Red/ET同源重组技术 2015年3月25日 内 容 一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用 遗 传 重 组 • 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息 • 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生 ，一种是突变，一种是遗传重组 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子） ◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 遗传重组与重组DNA技术 异常 广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程 一、 什么是Red/ET同源重组 1. 概念 Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组酶 Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同源 重组的DNA工程技术 2. 原理 首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp） 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组质 粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒 3. 特点： Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用 这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNARed同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行 ,大大推动功能基因组研究的发展 g b a l phage ET Rac phage u Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶（ Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用； u recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶； u recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白； u redγ： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBCD对外源线性DNA片 段的消化 λ噬菌体的pL操纵子示意图 Reda(RecE) Red同源重组原理示意图 Single-strand annealing Strand invasion 3’ 5’ Digestion Binding 3’ 5’ Redb(RecT) Repair/Replication Selection RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异 u “线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； u “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统； u 根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
质粒: l pSC101-BAD-gbaA(amp) l pSC101-BAD-gbaA(tet) l pSC101-BAD-gbaA(hyg) l pSC101-Tet-gbaA(tet) l pSC101-BAD-ETgA(tet) l pSC101-Tet-ETgA (amp) RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异 Red同源重组技术相关文献 Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000) 1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体 DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等； 2. 不受靶标DNA分子大小的限制； 3. 不受内切酶切位点的限制； 4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、 缺失、替换等的几率； 5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩 短实验周期 二、Red/ET同源重组技术的特点 三、 Red/ET重组的作用机制 Red/ET重组链入侵模型 1.链入侵模式 Red/ET同源重组链退火模型 2.链退火模型 四、 Red/ET重组中的功能元件 1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切酶 活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003） Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解 2. RecE和RecT RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火 3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保 守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活 力，增加电转化效率 五、 Red/ET重组操作流程 引物设 计合成 线性供体dsDNA 底物的制备 线性载体的 制备 重组反应 重组产物转化 至感受态细胞 重组子 筛选 重组子检测 1. 设计合成引物 设计引物时要遵循一般引物设计的基本原则，但是上下 游引物要加上15-20bp的载体同源序列载体同源序列如何 添加主要分以下两种情况： （1）载体酶切后是5’端突出或平末端，则引物上的同源序 列包括5’端突出序列的同源序列。
（2）载体酶切后是3’端突出，则引物上的同源序列不包括 3’端突出序列的同源序列 引物设计方法 同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998） 同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加 2. 线性供体dsDNA底物的制备 u 选用保真度高的DNA聚合酶（如Phusion、Pyrobest等，减少 PCR反应中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、 HotStarTaq 等），用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物； u 纯化PCR产物： （1）减少模板背景对筛选工作带来的难度； （2）降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； （3）去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率 u 降低模板对筛选工作带来的难度； （1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子 线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得 1）酶切 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。
2）PCR扩增 选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在18-20bp左右，建 议用高保真的聚合酶扩增为了避免模板质粒DNA对后续试验的影响，建议 用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率 不管采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需50ng/ul，高浓度的载体有 利于提高效率 3. 线性载体的制备 4. 同源重组反应 试剂加量 10x Buffer1ul Recombination Enzyme1ul 线性化载体（50ng/ul） 50-100ng 插入片段（50ng/ul）150-200ng dd H2O补足至10ul （1）配置反应体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进行重组反 应（摩尔比可计算方法见附录），10 ul体系(见下表) 注意：1.目的片段与载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效 率会降低；2.反应时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反应 （2）短暂离心混匀，37℃孵育15分钟 （3）反应结束后，取5-10ul反应液立即进行转化，剩余反应液可在4℃或 -20℃保存待用 5.重组产物转化至感受态细胞 冰上融化一管100 μl的DH5α感受态细胞。
加入5-10μl反应液到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上孵育 30分钟 42℃水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟 注意：所使用的感受态细胞效率≥1×108cfu/μg. 加入890μl SOC液体培养基，37℃复苏45-60分钟 6. 重组子筛选 u 复苏培养物8000rpm离心1分钟收集菌体，根据需要将一定 量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37℃倒置培养12-16h 后观察菌落生长情况 u 使用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子： 在10μg/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60μg/mL的卡那霉素平板上 重组子的数目的6倍 抗生素使用浓度与Red/ET重组效率的关系 常用抗生素的工作浓度 7. 重组子的检测 u 检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等； 一般采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定为避免假阳性结果，鉴定引物选 择一条为载体特异性引物，另一条引物为目的片段特异性引物 u 高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体” 现象； u “质粒多聚体”问题解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数 卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp ） “质粒多聚体” 现象 解决办法： u 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； u 利用RecE/RecT重组酶系统； u 减低质粒拷贝数。
六、 Red/ET重组技术的主要应用 1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning） 1. 重组质粒的构建 (1) 传统基因克隆技术的缺点 Ø 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切 酶的消化，当缺 少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时， 利用内切酶消化难以得到相应的产物 Ø 方法看似简单，但实验周期长 Ø 大片段难以与载体正确连接 Ø 无法同时连接多个（2个以上）的DNA片段 限制性内切酶 连接酶 步骤1： 酶切目的片段 步骤2：酶切载体 步骤3: 目的片段与载体连接 同源重组克隆步骤传统克隆步骤 步骤4: 重组子转化到感 受态细胞 同源重组克隆传统克隆 克隆片段 长度 50bp-10kb50bp-2kb 一次克隆 片段数 1-5个1个 感受态效 率要求 1×108cfu/ug以上1×107cfu/ug以上 所用的酶重组酶T4连接酶 片段的插 入位点 任何位点特定位点 片段酶切不需要需要 载体线性 化方法 酶切或PCR酶切 同源重组克隆与传统克隆比较 插入选择标记插入无选择标记的DNA片段 2. 染色体的修饰 E. coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较 （B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小 3. 亚克隆 （Subcloning） 4. 直接克隆 （Direct cloning） （A）亚克隆和直接克隆示意图 Red/ET subcloning 亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇 直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇 3 mg基因组DNA用EcoR V消化 Mx unknown PKS gene cluster (~36kb) p15A ori Cm PKS from other bacteria： Photorhabdus lumineciens Psedumonas flurescencse 。