药物分析一体化实验药物分析一体化实验克霉唑的合成、含量测定和最低抑菌浓度克霉唑的合成、含量测定和最低抑菌浓度 MICMIC 的测定的测定一、一、 实验目的实验目的1、 掌握克霉唑的性状、化学性质和药理作用2、 掌握格氏反应的原理及基本操作3、 进一步巩固重结晶的原理和实验方法4、 熟悉高效液相色谱的原理和操作5、 熟悉并掌握抗菌药物的最小抑菌浓度 MIC 的检测方法二、二、 实验原理实验原理（一）克霉唑的合成（一）克霉唑的合成克霉唑为白色或无色结晶性粉末溶于无水乙醇、丙酮和氯仿，几乎不溶于水，纯品熔点 142~145℃克霉唑是广谱抗真菌药物,特别是对真菌的深度感染有较高疗效克霉唑的合成主要以邻氯苯甲酸为初始原料，通过酯化反应、格氏反应、氯化、缩合而制得格氏反应是一个发生在金属表面的非均相反应电子从金属原子向反应基质 RX 的转移使反应开始，所生成的自由基阴离子由于其碳-卤键较弱而分解成一个自由基 R﹒和一个 X-，然后自由基再与镁反应在克霉唑的合成过程中，首先在对甲苯磺酸的催化下，邻氯苯甲酸与乙醇发生酯化反应然后生成的邻氯苯甲酸乙酯与格式试剂发生缩合反应得到含酮类化合物，再通过水解反应得到二苯基-（2'-氯苯基）甲醇（缩合物） 。
生成的醇与氯化亚砜进行分子内的亲和取代反应，最后与咪唑缩合反应生成克霉唑反应式：COOHClC2H5OH,℃ ℃ ℃ ℃ ℃ 12~15hCOOC2H5ClCOOC2H5ClMgBr℃ ℃ ,℃COMgBrClH2OH2SO4COHClCOHCl90℃ ,℃ ℃ 5hCClClSOCl2CCl30℃ ,3hNNClCl℃ ℃（二）克霉唑的含量测定（二）克霉唑的含量测定克霉唑在紫外光 260 nm 下有最佳吸收波长，本实验采用高效液相色谱法外标法室温检测高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成 （1）输液泵：①流量稳定；②流量范围宽；③输出压力高；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀 （2）进样器：一般 HPLC 分析常用六通进样阀，六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种 （3）色谱柱：色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等 （4） 检测器：HPLC 的检测器分为两类 ①通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化；②专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来三）克霉唑的抗菌实验（三）克霉唑的抗菌实验霉唑属吡咯类抗真菌药，具广谱抗真菌活性，对白念珠菌则可抑制其自芽孢转变为侵袭性菌丝的过程作用机制：该品通过干扰细胞色素 P-450 的活性，从而抑制真菌麦角固醇等固醇的生物合成，损伤真菌细胞膜并改变其通透性，以致重要的细胞内物质外漏;可抑制真菌的甘油三脂和磷脂的生物合成;也可抑制氧化酶和过氧化酶的活性，引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死白色念珠菌所致的皮肤念珠菌病和外阴阴道炎，由红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌所致的体癣、股癣、足癣和糠秕马拉色菌所致的花斑癣，也可用于治疗甲沟炎、须癣和头癣三、实验试剂及仪器三、实验试剂及仪器试剂试剂：乙醇、邻氯苯甲酸、对甲苯磺酸、碳酸氢钠、氯仿、镁、碘、无水乙醚、溴代苯、稀硫酸、氯化钙、甲苯、活性炭、石油醚、无水丙酮、霉唑重结晶产物、克霉唑对照品（100037） 、甲醇（色谱）等琼脂粉、改良马丁培养基、二甲亚砜、白色念珠菌仪器仪器：真空抽气泵、旋转蒸发仪、三用紫外线分析仪、电子天平、真空干燥箱、电动搅拌器、红外灯、高效液相色谱、全自动酶标仪、台式恒温振荡器、SW-CJ-2FD 洁净工作台、DH3600B电热恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌器、PL403 电子天平、超纯水系统、试管、烧杯、量筒、刻度吸管、圆底烧瓶、锥形瓶、培养皿、细胞培养板、新华 1 号滤纸、EP 管、接种环、枪头、移液枪等四、实验内容四、实验内容（一）克霉唑的含量测定（一）克霉唑的含量测定1 1、、邻氯苯甲酸乙酯的生成邻氯苯甲酸乙酯的生成在 250mL 干燥的三口烧瓶上，依次配置搅拌器、油浴锅和带有 CaCl2干燥管的回流冷凝管。
向三口瓶中加入 1g 邻氯苯甲酸和对 0.189g 甲基苯磺酸, 4.5g 无水乙醇，待溶解后，将温度调至 78℃，保持此温度，然后搅拌回流带水 12h向三口瓶中加入足量的饱和碳酸氢钠溶液并充分搅拌，然后加入适量的氯仿并搅拌测定上层溶液 PH 应大于等于 7，下层溶液 PH 应等于 7取下层溶液作为反应液，并将反应液转移至分液漏斗中进行萃取分取下层溶液旋蒸除尽溶剂，得到液状产物，产物呈淡黄或浅黄绿色计算收率2 2、、二苯基二苯基-（（2'-氯苯基）甲醇（缩合物）的生成氯苯基）甲醇（缩合物）的生成在 250ml 干燥的四口瓶中，依次配置搅拌器、油浴锅和带有 CaCl2干燥管的回流冷凝管及温度计向四口瓶中加入 0.215g 镁和 0.019g 碘, 0.7g 无水乙醚，室温下缓慢滴加溴代苯 1.942g-乙醚 0.8g，缓慢搅拌使溶液混合，滴加完毕后升温至 56-70℃回流 1.5h冷却 60℃以下，改装成蒸馏装置，在向四口瓶中滴加邻氯苯甲酸乙酯 1g-苯 2.5g 混合溶液，同时蒸出乙醚（在此步时，蒸乙醚时的温度控制在 60 度以下）待乙醚完全蒸出后，升至内温达 77-80℃，继续搅拌回流 4h，放置 10h。
搅拌下向反应液中加入苯 0.7g，再加入冷至 5℃以下的 8%稀硫酸，冰水浴下搅拌 20 分钟左右，酸度不够可加酸，保持溶液的pH 值为 1-2将反应液转移至分液漏斗中，静置，分取上层苯溶液，旋蒸尽可能除尽苯安装水蒸气蒸馏装置，将旋蒸液加入三口瓶中进行蒸馏，蒸馏至馏出液只有少许油状物时停止蒸馏，将反应物趁热转移至分液漏斗中进行萃取分取下层溶液进行旋蒸，冷冻放置直至呈现浅黄色稠状（若颜色较深可以进行硅胶色谱柱纯化处理） 计算收率3 3、、二苯基二苯基-（（2'-氯苯基）氯苯基）氯甲烷氯甲烷的生成的生成 称取 1g 二苯基-（2'-氯苯基）甲醇粗品，加入三口瓶中，然后加入 1g 甲苯及 0.043g活性碳,加热使粗品溶解，继续升温回流脱水，待脱水后，趁热抽滤，滤渣用少量甲苯洗涤，合并洗滤液将洗滤液加入干燥的三口瓶中，温度调至 50-60℃，缓慢滴加 0.83g 氯化亚砜，继续缓慢升温至 90℃左右，回流反应 5h，然后将反应液冷却至室温后，5℃以下放置 24 小时左右，析出白色沉淀，抽滤，滤饼用石油醚洗涤 2-3 次，得白色粉末状或块状固体，产品真空干燥计算收率4 4、克霉唑的制备、克霉唑的制备将咪唑加入三口瓶中，用适量无水丙酮溶解。
在 25~28℃时缓慢加入二苯基-（2'-氯苯基）氯甲烷 1g先慢慢升温至 45℃后然后设置温度为 30℃，待自然降温至 30℃左右，保温反应 3 小时，此时反应液中有白色固体析出向反应物中加入无水丙酮，于 55~57℃回流使溶解，然后加入少量活性炭，回流脱色半小时趁热过滤，滤饼用丙酮洗 2~3 次滤液旋蒸，除去 3/4 量的丙酮，冷却至室温后 5℃以下放置 15 小时以上可见白色固体析出抽滤，将滤饼用热水洗至洗液为透明，得白色块状固体，干燥测定熔点并计算收率二）（二） 克霉唑的含量测定克霉唑的含量测定1 1、色谱条件、色谱条件色谱柱：4.6×150nm流动相：甲醇—水（碳酸氢钠 2g，三乙胺 2.5ml,加水至 1000ml,冰醋酸调 PH2.5，微孔滤膜滤过） ，比例为 65：35流速：1.0ml﹒min-1柱温：25℃检测波长：260nm进样量：20ul2 2、标准曲线的绘制、标准曲线的绘制精密称取克霉唑标准品 50.24mg 置于 100ml 容量瓶中，加入适量的流动相，待完全溶解后用流动相稀释至刻度，摇均，作为对照品贮备液用移液管精密移取对照品贮备5.0ml、10.0ml、15.0ml、20.0ml、25.0ml 分别置于 25ml 的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇均。
分别取上述不同浓度的对照品溶液用微孔滤膜滤过后注入液相色谱进样瓶中，按照色谱条件对 5 种不同浓度的对照品溶液各进样 20ul，记录不同浓度对照品溶液的峰面积，以对照品溶液浓度（C）与其相应峰面积（A）作图求线性回归方程及相关系数3、样品含量的测定、样品含量的测定精密称取克霉唑样品 0.0300g,用流动相溶解后转移至 100ml 的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇均精密称取克霉唑标准品 0.0298g,用流动相溶解后转移至 100ml 的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇均分别取上述样品和标准品溶液用微孔滤膜滤过后注入液液相色谱进样瓶中按照色谱条件对标准品和样品溶液各进样 20ul分别记录标准品和样品溶液的出峰时间、峰面积、峰面积百分比（三）（三） 克霉唑的抗菌实验克霉唑的抗菌实验改良马丁液体培养基：用分析天平准确称取改良马丁培养基2.85 g，加入100 mL蒸馏水，放入灭菌锅（设定：温度：121 ℃，灭菌时间：15 min） ，搅拌使之充分溶解后，121 ℃高压灭菌15 min，于4 ℃保存备用改良马丁固体培养基：用分析天平准确称取改良马丁培养基2.85 g，琼脂1.4 g，加入100 mL蒸馏水，放入灭菌锅（设定：温度：121 ℃，灭菌时间：15 min） ，灭菌完毕后，在超净工作台上，等其温度降至约50-60 ℃时，以25 mL/皿倒入无菌培养皿中，制作平板固体培养基。
菌种的活化：将过夜培养的菌种按2.5 %的接种量，接种至含10 mL 改良马丁培养基的摇菌管中，于28℃，180 rpm 继续振摇培养20~24 h，使其达到对数生长期，用于后续实验将部分过夜培养的菌种涂布于固体培养平板中，倒置培养过夜，待菌落生长大小适当时，保存于4 ℃，可用于一周内的菌种培养活化使用克霉唑浓度的配制：直接用 DMSO 配成浓度为 1 mg/mL， 再配 4, 2, 1/2 ,1/4 ~1/512μg/mL 其 DMSO 含量为 3.5%96 孔板 MIC : 将药物按由高到低浓度自左至右加入 96 孔板中，然后加入菌液，在 28 0C 培养箱培养 20-24 小时，加入 MTT 溶液，继续培养 2 h 后，以肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度的孔作为两药物是否具有协同作用的判断指标，或使用酶标仪测定其在 570 nm波长处的吸光度值，以吸光度值的变化作为判断指标五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论1 1、克霉唑合成过程中的产率和、克霉唑合成过程中的产率和总产率总产率计算计算克霉唑合成产率克霉唑合成产率步骤产品产率1邻氯苯甲酸乙酯2二苯基-(2'-氯苯基)甲醇（缩合物）34二苯基-（2'-氯苯基）氯甲烷克霉唑2 2、克霉唑标准曲线的绘制和含量测定、克霉唑标准曲线的绘制和含量测定克霉唑对照品的浓度与面积表浓度 10-1mg/ml面积 mAU˙min对照品 11.004 对照品 22.008 对照品 33.012 对照品 44.016 对照品 55.020 克霉唑含量测定表克霉唑含量测定表浓度 mg/ml 出峰时间 min面积 mAU*min面积百分比%标准品0.2980 样品0.3000 3 3、抗菌实验结果、抗菌实验结果用用 9696 孔板测孔板测 MICMIC 结果结果克霉唑浓度（μg/mL）培养基21/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024六、思考题六、思考题1、。