琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤凝胶电泳加样实用课件

琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤凝胶电泳加样(实用课件)琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳泳Agarose￿gel￿electrophoresisAgarose￿gel￿electrophoresis2• 天天然然琼脂脂（（agaragar））: :又名琼胶、菜燕、冻粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物l 琼脂糖（脂糖（agaroseagarose））半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷D-D-D-D-半乳糖半乳糖半乳糖半乳糖3 核核酸酸凝凝胶胶电泳泳是是分分子子克克隆隆核核心心技技术之之一一，，用用于于分分离离、、鉴定定和和纯化化DNADNA或或RNARNA片片段段1.￿因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.￿对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象3.￿凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、 核酸、病毒 等大分子物质4.￿透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.￿样品易回收，常用于制备琼脂糖凝胶电泳的优点4缺点缺点1.￿机械强度差，易破碎，浓度不能太低2.￿易被细菌污染，不易保存，临用前配制。

3.￿琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色4.￿与PAGE相比，分子筛作用小，区带少 5一、一、实验目的目的 掌握掌握琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离泳分离DNADNA的原理和方法的原理和方法DNADNA分子在碱性分子在碱性缓冲液中冲液中带负电荷，在外加荷，在外加电场作用下向正极泳作用下向正极泳动DNADNA分分子子在在琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中泳泳动时，，有有电荷荷效效应与与分分子子筛效效应不不同同DNADNA的的分分子子量量大大小小及及构构型型不不同同，，电泳泳时的的泳泳动率率就就不不同同，，从从而而分分出出不不同同的的区区带二、二、实验原理原理琼脂糖是一种天然聚合脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有状分子，可以形成具有刚性的性的滤孔，凝孔，凝胶孔径的大小决定胶孔径的大小决定6琼脂脂糖糖凝凝胶胶电泳泳法法分分离离DNADNA，，主主要要是是利利用用分分子子筛效效应，，迁迁移移速速度度与与分分子子量量的的对数数值成成反反比比关关系系因因而而就就可可依依据据DNADNA分分子子的的大大小小使使其其分分离离该过程程可可以以通通过把把分分子子量量标准准参参照照物物和和样品品一一起起进行行电泳泳而而得得到到检测。

溴溴化化乙乙锭（（Ethidium Ethidium BromideBromide, ,￿EBEB））为扁扁平平状状分分子子，，在在紫紫外外光光照照射射下下发射射荧光光EBEB可可与与DNADNA分分子子形形成成EB-DNAEB-DNA复复合合物物，，其其荧光光强度度与与DNADNA的的含含量成正比据此可粗略估量成正比据此可粗略估计样品品DNADNA浓度 7三、三、实验材料、器具及材料、器具及药品品 质粒粒DNADNA样品 电泳泳仪，，电泳槽，泳槽，电子天平，移液器，子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射，微波炉，紫外透射检测仪等 琼脂糖，脂糖，1XTBE1XTBE电泳泳缓冲液，溴化乙冲液，溴化乙锭（（EBEB），），6X6X载样缓冲液冲液 四、四、实验步步骤 ⑴ ⑴ 1g 1g 琼脂脂糖糖加加入入100ml 100ml 1×TAE1×TAE电泳泳缓冲冲液液中中，，摇匀匀在在微微波波炉炉中中加加热至至琼脂脂糖糖完完全全溶溶解解冷冷却却到到60℃60℃，，加加入入100μl100μl的的0.5mg/ml 0.5mg/ml EBEB，，并并摇匀8⑵ ⑵ 用用胶胶带将将制制胶胶板板两两端端封封好好，，插插入入适适当当梳梳子子，，将将溶溶解解的的琼脂脂糖糖（（约50℃50℃）倒入，室温冷却凝固。

倒入，室温冷却凝固⑶ ⑶ 充充分分凝凝固固后后撕撕掉掉两两端端的的胶胶布布，，将将凝凝胶胶置置入入电泳泳槽槽中中，，加加1×TAE1×TAE电泳泳缓冲液至液面覆盖凝胶冲液至液面覆盖凝胶1-2mm1-2mm，小心垂直向上拔出梳子小心垂直向上拔出梳子⑷ ⑷ 用用移移液液器器吸吸取取总DNADNA或或质粒粒样品品4μl4μl于于封封口口膜膜上上，，再再加加入入2μl 2μl 的的6X6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点冲液，混匀后，小心加入点样孔 ⑸ ⑸ 打打开开电源源开开关关，，调节电压至至3-5V/cm3-5V/cm，，可可见到到溴溴酚酚蓝条条带由由负极极向向正正极移极移动，，电泳泳约30min-60min30min-60min9⑺ ⑺ 将将染染色色后后的的凝凝胶胶置置于于紫紫外外透透射射检测仪上上，，盖盖上上防防护观察察罩罩，，打打开紫外灯，可开紫外灯，可见到到发出出荧光的光的DNADNA条条带⑹ ⑹ 将凝胶放入将凝胶放入EBEB染液中染色染液中染色5-10min,5-10min,用清水稍微漂洗用清水稍微漂洗 1011121314151617181 2￿￿￿￿3￿￿￿￿M￿19 1 1、、DNADNA分子的大小分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 2、、琼脂糖脂糖浓度度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 3、、DNADNA的构象的构象 同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状DNADNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素204 4、凝胶和、凝胶和电泳泳缓冲液中的溴化乙冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。

5 5、所用的、所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比6 6、、琼脂糖种脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；21￿￿￿￿￿￿不同不同类型型琼脂糖的性脂糖的性质 琼脂糖脂糖类型型凝凝结温度温度/℃/℃熔化温度熔化温度/ ℃/ ℃ 标准准琼脂糖脂糖35~3835~3890~9590~95不同厂家生不同厂家生产的不同商品其的不同商品其凝凝结温度和熔温度和熔化温度有一定化温度有一定差异差异40~4240~4285~9085~90 高高强度度琼脂糖脂糖34~4334~4385~9585~95 修修饰的低熔点的低熔点/ / 凝点凝点琼脂糖脂糖25~3525~3563~6563~6535356565 超低熔点超低熔点8~158~1540~4540~45 低黏性低熔点低黏性低熔点琼脂糖脂糖25~3025~307070383885853030757522不同不同类型型琼脂糖分离脂糖分离DNADNA片段的范片段的范围浓 度度（（% %））标 准准(kb)(kb)高高强度度(kb)(kb)低熔点低熔点(kb)(kb)低黏度低溶点低黏度低溶点(kb)(kb)0.30.31~501~500.50.50.7~250.7~250.80.80.5~150.5~150.8~100.8~100.8~100.8~101.01.00.25~120.25~120.4~80.4~80.4~80.4~81.21.20.15~60.15~60.3~70.3~70.3~70.3~71.51.50.08~40.08~40.2~40.2~40.2~40.2~42.02.00.1~30.1~30.1~30.1~33.03.00.05~10.05~10.5~10.5~14.04.00.1~0.50.1~0.56.06.00.01~0.10.01~0.123常用的常用的电泳泳缓冲液冲液4℃ 保存保存备用用.7 7、、电泳泳缓冲液冲液24TAETAE和和TBETBE电泳泳缓冲液比冲液比较都是常用都是常用电泳泳缓冲液，二者相比：冲液，二者相比：1 1））TAETAE的的缓冲容量冲容量较低，如低，如长时间电泳会被消耗，此泳会被消耗，此时凝胶的阳极一凝胶的阳极一侧将将发生酸生酸性化；性化；2 2））TBETBE比比TAETAE花花费稍稍贵，但有高得多的，但有高得多的缓冲容量；冲容量；3 3）双）双链线状状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE中迁移快中迁移快10%10%；；4 4））对于高分子于高分子质量的量的DNADNA，，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE，，对于低分子于低分子质量的量的DNADNA，，TAETAE要差些。

超螺旋要差些超螺旋DNADNA在在TAETAE中的中的电泳分辨率要好于泳分辨率要好于TBETBE 25凝胶凝胶载样缓冲液冲液载样缓冲液：冲液：临上上样到凝胶加到凝胶加样孔之前与待孔之前与待电泳的泳的样品相混合的一种品相混合的一种缓冲液载样缓冲液有三个作用：冲液有三个作用：1 1）增加）增加样品密度保品密度保证DNADNA沉入加沉入加样孔内；孔内；2 2）使）使样品品带有有颜色便于色便于简化上化上样过程；程；3 3）其中的染料在）其中的染料在电场中以可以中以可以预测的泳的泳动速率向阳极迁移速率向阳极迁移266×6×凝胶凝胶载样缓冲液冲液类型型6 ×6 ×缓冲液冲液贮存温度存温度I I0.25%0.25%溴酚溴酚蓝4℃4℃0.25%0.25%二甲苯二甲苯氰40% (m/V)40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液IIII0.25%0.25%溴酚溴酚蓝室温室温0.25%0.25%二甲苯二甲苯氰15% 15% 聚蔗糖聚蔗糖(Type400)(Type400)水溶液水溶液IIIIII0.25%0.25%溴酚溴酚蓝4℃4℃0.25%0.25%二甲苯二甲苯氰30%30%甘油水溶液甘油水溶液IVIV0.25%0.25%溴酚溴酚蓝4℃4℃40% (m/V)40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液27琼脂糖凝胶中脂糖凝胶中DNA的的检测 通通过染色染色, , 紫外灯下紫外灯下检测。

主要采用溴化乙主要采用溴化乙锭（（ethidium bromide, EBethidium bromide, EB）染色法2829使用使用EBEB染色注意事染色注意事项（（1））EB被被认为是一种是一种强致癌物致癌物质（（2））EB可用来可用来检测单链或双或双链核酸核酸（（3））EB使用使用时的配制、的配制、贮存及使用存及使用 EB常用水配制成常用水配制成10￿mg/ml的的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包箔包裹的瓶中，使用裹的瓶中，使用终浓度度为0.5￿μg/ml￿4）当要知道）当要知道DNA片段准确大小片段准确大小时，凝胶，凝胶应在无在无EB情况下情况下电泳，泳，电泳泳结束后再用束后再用EB染色30凝胶中凝胶中DNA的成像的成像 可以用透射或入射紫外光可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝胶成像，染色的凝胶成像，图像可以直接像可以直接输出到出到计算机算机观察31关于关于琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳的泳的实验技巧和方法技巧和方法\ \几点注意事几点注意事项1）加）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否不要碰坏凝胶壁，否则DNA的的带型将不会整型将不会整齐，加，加样前要用前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。

品空中的气泡2）每孔最大）每孔最大DNA上上样量决定于量决定于DNA样品片段的大小、数目及品片段的大小、数目及样品孔形状与容品孔形状与容量3））应注意每孔最大上注意每孔最大上样容量及容量及样品孔体品孔体积，以免加，以免加样时样品流入附近品流入附近样品孔品孔造成交叉造成交叉污染，影响染，影响结果分析4）在）在实验加加样中不一定每一个中不一定每一个样品都品都换一个一个枪头，可在阳极槽中反复吸打，可在阳极槽中反复吸打电泳泳缓冲液以清洗冲液以清洗对于于Southern印迹印迹转移和需要回收移和需要回收DNA片段的片段的电泳，泳，则应该每一个每一个样品用一个品用一个枪头加加样，避免，避免样品交叉品交叉污染 32感感谢您的您的阅览【此课件下载后可自行编辑修改关注我￿￿每天分享干货】。