实验二多管发酵法测定水中大肠菌群总数一．实验目的和要求1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术2．巩固细菌学检验法的内容二．原理总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数试验结果以最可能数（mostprobablenumber）,简称MPN表示三．仪器（1）高压蒸气灭菌器2）恒温培养箱、冰箱3）生物显微镜、载玻片4）酒精灯、镍铬丝接种棒5）培养皿（直径100mm）、试管（5X150mm）,吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶四．测定步骤1．生活饮用水：① 初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于37°C恒温箱内培养24h② 复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽抱的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1〜3个，然后置于37C恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。
根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数2．水源水① 于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL1：10稀释的水样共计15管，三个稀释度将各管充分混匀，置于37C恒温箱内培养24h② 根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2“最可能数（MPN）表”即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10,即位1L水样中的总大肠菌群数例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1：10的水样1mL的5管均为阴性从最可能数（MPN）表中查检验结果5〜2〜0,得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49X10=490个对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做1：10、1：100、1：1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法如果接种的水样量不是10mL、1mL和O.lmL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：MPN值=MPN指数10(mL)接种量最大的一管(mL)附表1大肠菌群检数表接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）100mL水量的阳性瓶数10mL水量的阳性管数0121L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数1L水样中大肠菌群数0<3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230附表2最可能数（MPN）表（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）出现阳性份数每100mL水样中细菌数的最可能数95%可信限值出现阳性份数每100mL水样中细菌数的最可能数95%可信限值10mL管1mL管0.1mL管下限上限10mL管1mL管0.1mL管下限上限000<220171170012<0.5721071170102<0.5721192210204<0.51122092211002<0.57230123281014<0.51130081191104<0.515301112251116<0.515310112251206<0.515311144342005<0.513320144343211754652049171303301754652170231704001333152294282204011754653079251904101741121412264202242126430274313344034500235013450243510335114651263五、试验结果计算及分析。
54653111031250763532140373109785331804450076754013035300978541170431909805422205770011935432809085012935443501201000770550240687501189551350120100015110552540180140011935539203003200161205541600640580021150555三2400。