实验四 AS1.398 中性蛋白酶生产条件的优化及其活力的测定一、目的1 、熟悉微生物酶制剂的生产过程2 、掌握酶活力的检测方法3 、掌握确定最佳培养条件的方法二、 原理中性蛋白酶为水解酶的一种，可以将蛋白质水解成为氨基酸，是我国蛋白酶产量 最大的酶制剂品种，主要应用于皮革加工工业和食品工业本实验使用枯草杆菌 AS1.398 在实验室中模拟发酵生产中性蛋白酶酶制剂过程，确定以玉米粉、豆饼粉等 为碳源氮源的培养基配方等最佳产酶条件三、 主要仪器和材料（1） 摇床、培养箱、冰箱、灭菌锅、 超净工作台、低速离心机、 722-2000 分光光度计、1/100 天平、水浴锅、电热炉2） 枯草杆菌 AS1.398 、葡萄糖、玉米粉、豆浆、牛肉膏、蛋白胨、稀盐酸、氢氧化钠、酪氨酸标准液（100他/mL , 0.2 mol/L盐酸配制）、2%酪素（用pH=7.5磷酸缓冲液溶解）、0.4mol/L三氯乙酸、碳酸钠溶液（0.4mol/L ）、folin-酚试剂（1N ）四、操作步骤一）培养基的制备及灭菌1、 液体细菌培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，调节 pH7.2-7.4灭菌：115 C, 30分钟。
2、 摇瓶培养基基础培养基：KH2PO4 1.0g , Na 2HPO4 2.0 g , MgSO 4 • 7H2O 0.8g ,牛肉膏 0.7g（每 1000ml ）碳源：玉米粉 4%,葡萄糖 2%,氮源：豆浆 3%, 4%（二）培养1、 菌种活化：取保存枯草杆菌斜面，转接于空白斜面上， 37 C培养36h2、 菌种一级扩大培养： 取一环菌种接于装有 100ml 液体牛肉膏蛋白胨培养基的250ml的三角瓶中，37 C培养48小时3、 摇瓶发酵培养：取1ml菌液分别接于A （牛肉膏蛋白胨）、B （葡萄糖2% , 豆浆3% ）f C （葡萄糖2%，豆浆4% ）f D （玉米粉4%，豆浆3% ）f E （玉米粉 4%，豆浆4% ）液体培养基中，调节培养基的 pH值为7.4，37 C、240r/min 培 养 36h 三）酶活力的测定：1 、发酵液离心： 1200r/min 离心 20min ，取上清酶液 A、 B、 C、 D、 E2、不同培 养基 的酶活力测定：样品：取5只小试管，分别加入1 mLA、B、C、D、E酶液（先于40 C水浴中预 热3分钟），每个三角瓶中再加入1 mL酪蛋白溶液（先40 C预热3分钟）,摇匀， 在40 °C水浴中精确反应10min，立刻加入3mL三氯醋酸，摇动，静置10min , 滤纸过滤，用小试管收集滤液，放置 10min。
另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mLA、B、C、D、E过滤液、每管再依次加入 5ml 0.4M Na2CO3、1.0mL folin-酚试剂，摇匀，40 C水浴 20min，冷却，680nm 波长比色空白：取5只小试管，分别加入1mLA、B、C、D、E酶液、每管再加入3mL 三氯醋酸，混合后加入1mL酪蛋白，振荡，过滤，收集滤液另取5只10mL具塞刻度试管，分别加入1.0mL上述过滤液，每管再依次加入 5ml 0.4M Na 2CO3、1.0mL folin- 酚试剂，摇匀，40 C水浴 20min3、酪氨酸标准曲线的绘制：取8只小试管，按下表操作绘制标准曲线，做出回归方程编号1#2#3#4#5#6#7#空白标准溶液 ml0.10.20.30.40.50.60.700.2M HCI ml0.90.80.70.60.50.40.31.00.4M Na 283ml5.05.05.05.05.05.05.05.0Folin 液 ml1.01.01.01.01.01.01.01.040 C水浴，20min冷却680nm波长比色标准液卩g10203040506070OD0.1090.2140.3200.4390.5200.6130.7082Y=0.01067+0.01013x R2=0.99767五、结果处理以40 C、pH7.2条件下，粗酶液分解酪素每分钟产生 1⑥酪氨酸定义为一个酶活力单位。
汇总全班数据，比较各培养基的优劣1（K为标准曲线的斜率的倒数）每升发酵液酶活力单位数=OD K 5 — 100010=K OD 5 102六、实验分组每组5人，每班6组附表1实验试剂实验试剂用量实验试剂用量酪氨酸标准液（500旧/mL）每班100mL0.2M HCI每组10mL1%酪素（pH7.2磷酸缓冲溶液）每组100mL0.4M Na2CO3每组100mL三氯乙酸每组100mLfolin-酚试剂每组20mL附表2实验玻璃仪器实验玻璃仪器用量实验玻璃仪器用量250mL三角瓶（做棉塞）5个/组大离心管5个/组玻棒、100mL、250mL烧杯各1个/组50mL具塞三角瓶10个/组100mL、250mL 量筒每组各1个移液管每组4个1 mL , 1个2 mL,3 个 10 mL试管17个/组（10个也可）三角漏斗10个/组标签纸4张10mL具塞刻度试管7个/组滤纸2盒。