实验二（2）转氨幅（GPT活性的测定一． 研究背景及目的转氨酶是生物体内重要的一类酶转氨酶催化a -氨基酸的氨基与a -酮酸的 酮基之间的相互转化而生成一种新的氨基酸与一种的新的酮酸， 这种作用被称为 转氨基作用[1]转氨酶种类很多，体内除了赖氨酸、苏氨酸外，其余 a-氨基酸 都可参加转氨基作用并各有其特异的转氨酶其中以谷丙转氨酶（ GPT和谷草 转氨酶（GOT最为重要GPT与GOT舌性的测定在临床上有着重要应用，可作 为一些疾病诊断的指标GPT崔化的是谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，GOT崔化的是谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用， 草酰乙酸在柠檬酸苯胺溶液中可以转 变为丙酮酸与二氧化碳 由于都有丙酮酸的生成， 所以可以通过实验测定一定时 间内丙酮酸的生成量而计算这两种转氨酶的活性 本实验以动物的新鲜肝脏和血 清为材料，分别测定其中的GTP的活性，以此来研究该转氨酶活性的测定方法二． 原理由于动物肝脏和血清中的转氨酶活性较高， 易于测得， 且动物或人的转氨酶活性的测定应用广泛、 技术成熟， 因此本试验选取家兔的新鲜肝脏和血清为实验 材料，对其中的一种重要转氨酶一一 GTP的活性进行测定转氨酶活性测定的历 史沿革建立了金氏法、 穆氏法及赖氏法等较成熟的基本方法， 本实验采用的是金 氏法。
该方法对转氨酶活力的定义是：血清在37℃， pH7.4 条件下，与底物作用60min后，每生成1仙M丙酮酸为一个转氨酶活性单位丙酮酸含量的测定运用的是比色法丙酮酸可与2,4- 二硝基苯肼反应，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，所以通过测定溶液在520nm下的光吸收值并与标准溶液比色 便可计算出丙酮酸的含量，丙酮酸的含量对应于一定的转氨酶活力单位三． 材料、试剂与仪器 材料 ： 新鲜家兔肝脏和血清试剂 [1] ：① 磷酸盐缓冲液（ pH7.4 ）甲液：1/15 mol/L 磷酸氢二钠溶液乙液：1/15 mol/L 磷酸氢二钾溶液取甲液825ml,乙液175ml,混合，测得pH为7.4即可②GTP基质液称取a -酮戊二酸29.2mg及DL-丙氨酸1.78g ,溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，再加缓冲液70ml,并移入100ml容量瓶中，加1mol/L的氢氧化钠溶液0.5ml, 校正 pH 至 7.4 ，再以 pH7.4 的磷酸盐缓冲液定容贮存于冰箱中备用，可保存一周时间③ 2,4- 硝基苯肼溶液称取2,4二硝基苯肥20mg先?§于10ml浓盐酸中，再以蒸储水稀释至100ml, 棕色试剂瓶内保存。
④ 丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠22mg溶解后转入100ml容量瓶中，用pH7.4的磷酸盐缓冲 液定容即可⑤ 柠檬酸苯胺溶液取柠檬酸 50g 溶于 50ml 蒸馏水中，再加苯胺充分混合即可，低温出现结晶时，可置于37℃水浴中溶解后应用⑥ 0.4M 氢氧化钠溶液 仪器 ：DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司，编号L304056）TPL-4OB1氐温台式离心机（上海安亭科学仪器厂，编号20070529）722 光栅分光光度计（上海紧密科学仪器有限公司）大龙系列加样器及吸头（20-200屋，100-1000 l , 1000-5000以）JP-100 架盘药物天平（美国双杰兄弟有限公司，编号3878）配平天平（北京医用天平厂）刻度试管，离心管，小烧杯，匀浆器，洗瓶，冰浴四． 操作步骤1． 取 健康家兔，处死心脏采血，分装至离心管（生理盐水浸润）， 4000 转低温离心15min,取上清液冰浴待用取肝脏，生理盐水冲洗沥干，取1g匀浆， 用磷酸盐缓冲液定容至10ml, 4000转低温离心15min,取上清液，冰浴，记 为肝脏研磨液1取2ml肝脏研磨液1,用磷酸盐缓冲液定容至4ml,冰浴， 记为肝脏研磨液2。
2． 取 6 支试管，编号，按下表操作[1]管号123456丙酮酸标准液00.050.100.150.200.25GPI底物0.500.450. 400.350.300.25磷酸盐缓冲液0.10.10.10.10.10.1再取18支试管，分为三组，每组6支，分别用于测定血清、肝脏研磨液 1、 肝脏研磨液2的GPT舌性，6支试管中3支作为测定管，另外3支作为对照管 按下表操作：试剂（单位ml）测定管对照管血清或肝脏匀浆液0.10.137 c 水浴 5minGPI底物0.5将完成以上操作的24支试管按下表操作:37 c 水浴 30min各管加入2,4-二硝基苯肥0.5ml9支对照管中各加入GPTK物0.5ml37 c 水浴 20min各管力口入 0.4M NaOH5.0ml10min后从水浴中取出各试管，待冷却至室温，520nm下比色，记录消光值五.数据整理1.标准曲线相当于谷丙转氨酶单位0285797150200OD52000.0980. 1750. 2510.3000.358标准曲线2. GPT活性测定2.1血清中GPT舌性的测定六.结果计算与分析根据标准曲线方程y=0.0017x+0.0464 （y对应于ODfi, x对应于酶活单位）计算各三种样品光吸收值（以测定管均值与对照管均值之差计算）对应的酶活单位，结果汇总如下:样品血清肝脏研磨液1肝脏研磨液2GPT舌性单位36.8234.5214.5以上结果显示：血清中GPT舌性较高，而肝脏中的GPT舌性特别的高，尽管 稀释了一定的倍数，仍然超出了标准曲线设定的范围。
我们知道，研磨液2是由 研磨液1稀释2倍得到的，但是其活性完全与稀释倍数不成比例 我认为这是由 两个方面的原因造成的：①肝脏中GPT舌性过高，催化反应中GPT±量，其活性 没有得到完全的体现，所以稀释后活性没有按稀释倍数降低；②肝脏研磨液稀释 倍数不够，使得产物浓度超出了比色法的线性范围， 最终导致通过标准曲线方程 计算得到的酶活单位存在较大误差七.结论与展望通过以上的计算与分析， 本实验得到的结论是： 通过比色法测定一定时间内转氨酶催化反应的产物的含量来表征转氨酶的活性的方法是可行的， 关键的问题在于如何确定底物及酶的浓度从而使得酶的活性得到最大程度的发挥且底物浓度适于比色法的测定 本实验中由于肝脏中转氨酶活性过高， 稀释倍数不够， 导致产物浓度过大， 超出了比色法的最适测定范围， 得到的数据误差较大 所以希望以后的实验能够调整肝脏研磨液的稀释倍数，更加准确地测定转氨酶的活性八． 实验小结本次实验比较成功， 实验过程中没有出现明显失误 由于实验室配备了加样器取代了原来的移液管， 使得加样速度大大提高， 最终我们小组在较短时间内顺利完成了实验 此外从实验数据中也发现： 各平行实验数据相差较小， 可见平行性良好，实验操作带来的偶然误差较小。
九． 参考文献[1] 生物化学实验指导19-22 中国农业大学生物化学实验室 中国农业大学自编教材附：两种酶活性测定实验的主要设计细节异同点分析比较：淀粉酶与转氨酶活性的测定在实验的整体思路上是相同的， 但是实验设计上存在着许多不同之处，各自具有其特点，具体表现为以下几点：首先， 制备酶液的方法不同： 淀粉酶活性测定中采用的是萌发的小麦种子的研磨稀释液， 转氨酶活性的测定中采用的是家兔的血清及肝脏研磨稀释液 作如此选择是出于实验的可操作性及现实意义的考虑 萌发的种子中的淀粉酶活性和动物血清及肝脏中的转氨酶活性都比较高， 所以选取它们易于较准确地测得酶活性；此外，萌发的种子中淀粉酶活性的测定对于农业生产具有重要的指导意义，而动物或人的血清及肝脏中转氨酶活性的测定在临床上具有重要应用， 所以以它们为实验材料的研究在技术上比较成熟而且具有现实意义第二，淀粉酶活性测定实验是以两种淀粉酶一一a淀粉酶和B淀粉酶为研究 对象的，而转氨酶活性测定实验是以一种转氨酶GPT为研究对象的也就是说，淀粉酶活性测定实验以一种生物材料来研究两种淀粉酶的活性而转氨酶活性测定实验以两种生物材料来研究一种转氨酶的活性具体的实现测定的策略分别是：淀粉酶活性测定实验分别测定a淀粉酶 （抑制了 B淀粉酶活性）活性及两种 淀粉酶的总活性；转氨酶活性测定实验分别测定了血清中的GPT活性及两种不同稀释倍数的肝脏研磨液的 GPT舌性。
如此设计主要出于两方面的考虑：实验的可 操作性及典型性因为对于淀粉酶的测定，通过抑制B淀粉酶活性来测定a淀粉 酶活性是易于实现的；而对于转氨酶活性的测定，GP说一种体内最重要的转氨酶之一，所以其活性测定具有典型性，通过测定GPTS不同组织中的活性能够实 现转氨酶活性研究的目的第三， 酶活性的测定是通过酶促反应的产物测定实现的， 淀粉酶活性测定实验中测定的产物是麦芽糖，这是因为两种淀粉酶催化反应的产物几乎都是麦芽糖， 所以麦芽糖的产量能够表征淀粉酶的活性， 而且麦芽糖的含量易于通过比色法测得； 同样道理， 转氨酶活性测定实验中测定的是催化产物中的丙酮酸的含量第四， 酶活力单位的定义不同： 淀粉酶活力单位的定义是： 每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数； 转氨酶活力单位的定义是： 血清 （或肝脏研磨液）在37 C, pH7.4条件下，与底物作用60min生成1仙M丙酮酸为一个转氨酶 活力单位第五，酶促反应的条件不同，主要表现在温度的不同：淀粉酶的反应是在40℃下进行的，而转氨酶的反应在37℃这是由于这两种酶的最适温度不同，淀粉酶的最适温度是40℃而转氨酶的最适温度是37℃，由于酶活性的测定要求在“最适条件下”测定，所以设定这样的反应温度。
第六，酶促反应的时间不同：淀粉酶活性测定的反应时间为准确的 5 分钟，而转氨酶活性测定的反应时间是30min这是由这两种酶促反应的特点决定的：淀粉酶催化的反应快速灵敏， 在较短时间内完成； 而转氨酶催化的反应属于可逆反应，反应速率较慢，需要较长的时间反应才能够建立平衡第七， 酶活力测定的要求之一是保证测定的是反应的初速度， 那么这两个实验分别是如何实现的呢？淀粉酶活性测定实验中通过制备低浓度酶液以及控制短时间的反应来保证反应的初速度； 转氨酶活性测定实验中则通过底物浓度的设定来保证反应的初速度 这是基于这两种酶促反应动力学特性来设计的： 淀粉酶的催化反应在短时间内完成， 酶活性很高， 所以要求以低浓度的酶液在短时间内反应； 转氨酶催化的反应属于双底物可逆反应， 反应速率较低， 所以通过设定过量的底物以及合理配制两种底物的比例即可保证反应的初速度第八， 实验整体的复杂度不同： 综合来看， 转氨酶活性测定实验的复杂度较淀粉酶活性测定实验的高 这是因为： ①转氨酶催化反应的机理较淀粉酶的复杂前者为双底物可逆酶促反应， 后者为单一底物的不可逆酶促反应 可见转氨酶活性测定的实验的干扰因素比较复杂， 其底物浓度及两种底物浓度比等也成了实验的影响因素。
此外转氨酶催化反应的可逆性决定了只能测定原始的产物浓度而不能像淀粉酶活性测定实验那样将产物经过稀释等处理后再进行测定， 这就使得测定的酶液浓度受到严格的限制，因为比色法测定底物浓度的范围是受到限制的②实验材料不同 转氨酶活性测定实验采用的是动物的血清和肝脏而淀粉酶活性测定实验采用的是植物萌发的种子显然动物材料较难。