生物制品分析概论山东省药品检验所 石峰Email：zjubiolab@Tel：139531751231¨1、生物制品药物分析有那些特点 ？¨2、为什么必须对生物制品进行全 程质量控制？问题问题2第一节 概述化学药物、生物药物、中药生物药物 （来源和生产方法）生化药物生物合成药物生物制品3生物药物¨利用生物体、生物组织或组成生物体的各 种成分，综合运用生物学、生物化学、微 生物学、免疫学、物理化学和药学的原理 与方法制得的一大类药物4生物药物发展过程：u第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天 然活性物质与混合成分的粗提取物制剂：鱼肝 油、胰酶及其肠溶、甲状腺粉及其制剂等u第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近 代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对 性治疗作用的特异生化成分如：尿激酶、肝 素钠、胰岛素、人血白蛋白等u第三代：应用生物工程技术生产的天然生理活 性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的 具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然 物质结构不同的全新的药理活性成分如：重 组人生长激素、重组人胰岛素等 5生化药物¨定义：半合成或用现代生物技术制得的生命 基本物质及其衍生物、降解物以及大 分子的结构修饰物等，如氨基酸、多 肽、蛋白质、酶、多糖、脂质、核甘 酸类。
6生物合成药物¨定义:由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生 物及其酶转化反应共同完成的半合成药物, 如: 山梨醇、木糖醇、甘露醇、维生素、甾 体激素、酶与辅酶类药物等7生物制品¨定义用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质 工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、 细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物 材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断 的药品包括：细菌类疫苗、病毒类疫苗、 抗毒素及免疫血清、血液制品、细胞因子、 体内及体外诊断制品以及其他活性制剂微生态制剂:双歧杆菌 8生物制品的种类和特点根据所采用的材料、制法或用途不同，可分为六类:u疫苗类药物 u抗毒素及抗血清类药物 u血液制品 u重组DNA制品u诊断制品 u其他制品9疫苗类药物定义:用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚， 或经组织培养后加以处理制造 分类:（1）细菌类疫苗：由有关细菌、螺旋体或 其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、 重组DNA疫苗、亚单位疫苗等如：皮内 注射卡介苗、吸附破伤风疫苗、乙型脑炎 减毒疫苗、人用狂犬病疫苗等10（2）减毒类疫苗：由病毒、衣原体、立克 次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活 疫苗、重组DNA疫苗、亚单位疫苗等。
如 ：口服脊髓灰质炎减毒疫苗麻疹减毒活疫苗风疹减毒活疫苗腮腺炎减毒活疫苗重组乙型肝炎疫苗甲型肝炎减毒活疫苗流感全病毒灭活疫苗11（3）联合疫苗：指两种或两种以上疫苗 原液按特定比例配合制成的具有多种免疫 原性的灭活疫苗或活疫苗如：伤寒副伤寒甲乙联合疫苗吸附百白破联合疫苗麻疹腮腺炎联合减毒疫苗12（4）双价疫苗及多价疫苗：由单一型抗 原成分组成的疫苗通称单价疫苗有两 个或两个以上同一种但不同型抗原合并 组成的含有双价或多价抗原成分的一种 疫苗，则分别称为双价疫苗或多价疫苗 13抗毒素及抗血清类药物定义：凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大 动物所得的免疫血清叫抗毒素或抗毒血清如 ：破伤风抗毒素白喉抗毒素肉毒抗毒素凡用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物所得 的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清如：抗蝮蛇毒血清抗五步蛇毒血清抗狂犬病血清14血液制品定义：由健康人的血液或经特异免疫的人 血浆，经分离、提纯或重组DNA技术制成 的血浆蛋白成分，以及血液细胞有形成分 统称为血液制品如：人血白蛋白人免疫球蛋白人凝血因子Ⅷ15（二）生物制品的特点u分子量不是定值大部分生物制品的活性 组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、 多肽、核酸、多糖类等）。
组分相同，但 相对分子量不同而产生不同的生理活性， 因此常需进行相对分子量的测定 u生化法结构确证由于有效结构或分子量 不确定，其结构的确证很难沿用化学药物 或结构已知的生化药物所常用的方法，还 需要生物化学分析如：氨基酸组成、N末 端氨基酸序列、肽图等16u需检查生物活性 生物制品对热、酸、碱 、重金属及pH等变化敏感，各种理化因 素的变化易对生物活性产生影响特别 是多肽和蛋白质除理化分析，还需生 物检定，防止蛋白质失活 u要求安全性检查 物制品组分复杂，有效 成分浓度很低，生物大分子杂质含量比 较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质 和污染物如重组乙型肝炎疫苗涉及的 安全性检查包括：细胞外源因子检查、 原液、半成品、成品中有关血清白蛋白 残留量、CHO细胞DNA残留量检查、热 原检查、过敏试验、异常毒性检查等 17u需做效价测定 对于生物制品有效成分的 检测，除应有一般化学方法或理化分心 进行有效成分含量测定外，更应根据产 品的特异生理效应或专一化反应拟定其 专属性的生物效价测定方法，以表征其 所含生物活性成分的含量 例：人凝血酶原复合物的效价测定18三、生物制品的全程质量控制¨生物制品化学性质与生物学性质都很不 稳定，又易受微生物污染，故对生物制 品的均一性、有效性、安全性和稳定性 等应有严格要求，以生产出具有药理活 性高、针对性强、毒性低、副作用小， 疗效可靠及营养价值高等特点的安全、 高效的生物制品。
为此，必须进行原材 料、生产过程和最终产品的全程质量控 制，以确保产品符合质量标准要求19生物制品及检定规程草案（1952年）生物制品制造检定规程（1959年）中国生物制品规程（2000年）中华人民共和国药典三部（2005年）中华人民共和国药典三部（2010年）20药典三部各论内容¨品名¨定义、组成及用途¨基本要求¨制造¨检定（原液、半成品、成品）¨保存运输及有效期¨使用说明（仅预防类含此项）21生物制品u品名u定义、组成及用途u基本要求u制造u检定（原液、半成品、 成品）u保存运输及有效期u使用说明（仅预防类含 此项）化学药品Ø品名Ø化学结构、分子式Ø性状Ø鉴别Ø检查Ø含量测定22生物制品质量控制重点u有效成分的同一性、结构确证 u有效成分的均一性、纯度检查 u有害物质及残余杂质等的控制 u高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法生物制品质量控制基本方法 u 鉴别试验 u 杂质检查 u 安全性检查 u 含量测定（生物活性或效价）23第二节 鉴别试验¨依据生物制品的化学结构、理化性质和生 物学特点，利用化学法、物理法及生物学 方法进行某些特殊反应，或测定某些专属 的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电 泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，判断 与确证产品的真伪。
一组实验）24一、理化鉴别法Ø1、化学鉴别法利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜 色的产物或沉淀进行鉴别如胰岛素的沉淀反应Ø2、紫外分光光度法蛋白质生物制品主要由芳香族氨基酸侧链如酪氨酸 、色氨酸、苯丙氨酸产生紫外吸收如重组人促红素 最大吸收279nmØ3、高效液相色谱法 （主峰保留时间和肽图的一致性 ）例如脑蛋白水解液 不同批次肽图的一致性25二、生化鉴别法Ø1、酶法利用酶对底物特异性的催化活力，做为 酶类生物制品简便、快速鉴别方法 如尿激酶的鉴别 Ø2、电泳法等电点聚焦电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等 可用于蛋白质类生物制品的鉴别如重组人生长激素的鉴别： SDS聚丙烯酰胺凝 胶电泳26三、 生物鉴别法（一）血清学法-体外抗原抗体试验 抗原抗体类生物制品的鉴别抗原抗体在体外结合时，可因抗原物理性 状不同或参与反应的成分不同而出现各种类型 的反应，如凝集反应、沉淀反应、中和反应和 补给结合反应，即经典血清学反应，在此基础 上，又衍生出免疫扩散、免疫电泳、荧光标记 、酶标记等高度敏感的检测技术27（二）生物学法¨利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为 基础进行供试品的鉴别来鉴别药物。
¨例如: 小鼠惊厥试验鉴别胰岛素¨ 肝素延长血凝鉴别肝素28第三节 杂质检查可用来判断药品的优劣由于生物制品来 自生物体，生物活性特特异性强，制造与 纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有 时产品并非单一，极微量杂质可能产生显 著的效应，因此，其杂质检查显得尤为重 要主要包括： ¨ 一般杂质检查 ¨ 特殊杂质检查 ¨ 安全性检查29¨一般杂质检查氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、 铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度、 溶液的颜色、水份及干燥失重、炽烧残 渣30一、特殊杂质检查从原料中带入或生产工艺中或贮藏过程中引入 的杂质根据生物制品的生产工艺特点与产品的稳 定性，其特殊杂质分为： u生物污染物：微生物污染、宿主细胞蛋白、外 源性DNA、培养基成分等u产品相关杂质：二聚体和多聚体、脱氨或氧化 产物、突变物、裂解产物等 u工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂聚乙二 醇、乙醇、佐剂氢氧化铝，产品稳定剂如辛酸 钠、肝素，防腐剂苯酚、硫柳汞，细菌与病毒 灭活剂甲醛、戊二醛等31（一）宿主细胞蛋白残留量测定¨生物制品生产用细胞、工程菌相关的特殊 杂质¨方法：ELISA32（二）外源性DNA残留量的检查¨测定方法：¨分子杂交技术¨基于DNA结合蛋白分析系统¨实时定量PCR方法33（三）产品相关杂质检查¨生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保 存过程中产生的与产品结构类似的同系物 、异构体、突变物、氧化物、聚合体或降 解物。
¨常用HPLC法和电泳法¨如重组人生长激素中相关蛋白质的测定总相关蛋白质含量不超过10%34（四）残余抗生素的检查¨如果生物制品在生产过程中使用了抗生素 ，则不仅要在纯化工艺中除去，而且要在 原液检定中增加残余抗生素活性的检测方 法 ¨常用方法：抑菌圈测量 ¨结果判定：对照溶液有抑菌圈，阴性对照 无抑菌圈，供试品溶液抑菌圈的直径小于 对照溶液抑菌圈的35二、安全性检查¨（一）热原检查法和细菌内毒素检查 法 ¨（二）异常毒性检查 ¨（三）过敏试验检查异性蛋白 ¨（四）降压试验检查组胺、类组胺或其他导致血压下降 的物质 ¨（五）无菌试验检查药品及敷料是否有活菌的一种方法36第四节 含量（效价）测定（一）含量测定 表示方法：百分含量：适用于结构明确的小分子药物或经水解变 成小分子的药物 测定方法： 1、HPLC 2、SDS-PAGE （二）效价测定 表示方法：生物效价或酶活力：适用于酶类或蛋白质类药物37一、理化分析法（一）滴定分析法根据生物制品中某些成分能与标准溶液定量地 发生酸碱中和反应、氧化还原反应等特性，通过 滴定进行含量测定如胰酶中胰脂肪酶的测定 以橄榄油为底物，经胰脂肪酶水解后产生脂肪酸 ，用氢氧化钠液滴定。
38（二）光谱分析法1、比色法例如：硫酸软骨素的测定 2、紫外分光光度法糜蛋白酶与底物N-乙酰-L-酪氨酸 237nm测定 3、荧光分光光度法反应物或反应产物激发产生应观荧光应用荧光试剂产生荧光应用另一酶的催化反应产生荧光39（三）HPLC法¨特点：适合于对高沸点、大分子、强极性和热 稳定性差¨ 色谱柱：C8、C18流动相：甲醇-水（或缓冲液）、 乙腈-水 （或缓冲液）检测器：UV、荧光、ECD色谱条件：40高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）¨多肽及蛋白质等生物药物的分离及其分子量测定¨特点：活性蛋白质可以回收流动相通常为缓冲液，为改善分离，可加少量 有机改性剂或表面活性剂根据有效粒径分离 ¨ 41HPGFC测定rh-TNF衍生物的分子量色谱条件： ¨色谱柱：SEC-3000柱 ¨流动相：0.01mmol/LKH2PO4：0.1mmol/L Na2SO4（1：1），内加0.05%叠氮化钠 ¨流速：1mL/min¨柱温： ¨检测波长:280nm4243二、生化分析法44（一）酶法（一）酶法l酶法 酶活力测定法—以酶为分析对象l 酶分析法—以酶为分析工具。