PCR扩增反应一、实验原理PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的 DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性 质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工 合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为 双链DNAPCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链 DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系 中引物DNA量大大多于模板DNA,使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少③延伸：在DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg2+存在的条件 下，5'-3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循 环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段 得到了大量复制，数量可达2X106〜7拷贝图反应历程nriru 二、实验材料1 •模板：细菌DNA 2・TsgDNA聚合酶3・dNTP混合液4・10 倍浓度 PCR 缓冲液 5 ・2.5mmol/LMgC12 6 -RAPD 引物:S14 S15 S18 S66 S74S88 S97 S103 S110 S115 7 •提取细菌DNA的相关试剂试剂浓度加入量10倍浓度PCR缓冲液2.5ul氯化镁溶液2.5mmol/L2.5uldNTP混合液各 2.5mmol/L2.5ul上游引物2.5umol/L2.5ul下游引物2.5umol/L2.5ul细菌DNA25~50ng 2.5ulTsgDNA聚合酶2.5U超纯水10ul总体积25ul三、操作步骤1.细菌染色体DNA的提取（见上一组）2．RAPD 反应体系的配置3 ・反应程序：加样顺序—!将RAPD反应试剂加入EP管中轻混后用lOOul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸 发，盖好盖子打开PCR反应仪输入以下反应数据• 94摄氏度预变性5min• 94摄氏度变性40s• 40 摄氏度退火 40s• 72 摄氏度延伸 1min将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min仪器为 Model MyGene 25 Plus三、注意事项1、 PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。
2、 为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖3、 加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶4、 置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应5、 引物条件 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二 聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。