2种蚯蚓对土壤锌离子的生理响应对比研究 张军辉 李艳 田舒宁 杨光 郭新月 胡锦雯 郭华摘 要：以赤子爱胜蚓、太平二号蚓为试验对象，分别对其展开锌离子的急性毒性试验、耐受限度试验和富集效应试验，探究利用蚯蚓对污染土壤进行联合修复的可能性结果表明，赤子爱胜蚓的LC50值在800～1200mg/kg，太平二号蚓的LC50值在400～800mg/kg;赤子爱胜蚓体重受Zn2+限制的程度低于太平二号蚓;赤子爱胜蚓及太平二号蚓对土壤中均具有一定的富集能力，赤子爱胜蚓对土壤中锌离子的富集量更大关键词：赤子爱胜蚓;锌污染;重金属X173;X53 A 1007-7731（2020）14-0117-03Abstract： In this study， we conducted the acute toxicity experiment， tolerance limit experiment and enrichment effect experiment of zinc ions on Chizi Aisheng Earthworm and Taiping No.2 Earthworm， aiming to explore the possibility of using earthworms to carry out joint remediation of contaminated soil， which provides theoretical support for the domestication of earthworms and breed selection. The experimental results show that the LC50 value of Chizi Aisheng worm is between 800-1200mg/kg， and the LC50 value of Taiping No. 2 worm is 400-800mg/kg; Earthworms; Chizi Aisheng Earthworm and Taiping No. 2 Earthworm have a certain enrichment capacity in the soil， and Chizi Aisheng Earthworm has a greater concentration of zinc ions in the soil.Key words： Eisenia foetida; Zinc pollution; Heavy metal1 引言蚯蚓是土壤中生物量最大的一类动物，约占土壤动物生物总量的60%，在维持土壤生态系统功能方面起着不可替代的作用。
同时，蚯蚓处于食物链的底端，与土壤中各类污染物密切接触，最易受到土壤环境中有害物质的伤害[1]当土壤中重金属含量超过一定限度时，会引起蚯蚓体重下降、蚓体畸形等毒害症状，并诱发逃逸行为，严重者甚至死亡[2-3]但是，有些品种却为重金属耐受型，如白颈环毛蚓、壮伟环毛蚓、湖北环毛蚓和毛利环毛蚓等，它们可通过解毒和富集机制，存活于重金属污染的土壤中[4]蚯蚓对土壤重金属有富集作用，且主要是通过摄食作用和被动扩散作用而实现[5]因此，采用蚯蚓对城市污泥进行处理，可使污泥中重金属含量显著降低，将蚯蚓应用于生态系统污染土壤的生态修复具有一定的发展潜力[6]赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）是表层种蚯蚓中应用于研究最广泛的品种，其繁殖率高，成熟周期短约8周，易于实验室批量培养，其处理土壤能够提高重金属的生物可利用性，被多个国际标准毒性试验列为参比蚓[7]太平二号蚓即印度蓝蚯蚓（Perionyx excavacus），其繁殖率高，适应性强，是目前蚯蚓市场上流通最广的种类[8]目前尚无比较赤子爱胜蚓和太平二号蚓对于土壤中锌离子富集能力差异，以及它们在不同锌离子浓度土壤中致死率和生长抑制率的研究为此，笔者对2种蚯蚓的在不同锌离子浓度土壤中的致死率、生长抑制率和锌离子富集能力开展了对比研究。
2 材料与方法2.1 试验材料 赤子爱胜蚓购自江苏省句容市蚯蚓养殖场，太平二号蚓购自广东东莞蚯蚓养殖基地2类蚯蚓购入时均为1月龄综合文献资料及前期试验，试验用蚯蚓的培养条件设置为：塑料2.5L养殖盒，土壤湿度50%，营养土层与发酵干牛粪层厚度为2∶1，每个蚯蚓养殖盒中蚯蚓条数为10～45条，温度为20～25℃，光照条件光暗比为6h/18h，培养至2月龄后进行试验2.2 试验方案2.2.1 急性毒性反应试验 设置1个对照组，3个试验组，在大培养皿中加入泥土和少量干牛粪（饲料），润湿后，放入空腹蚯蚓30条实验组逐步加大土壤中锌离子的浓度（100、200、400、800、1200mg/kg），找出死亡率接近0%和100%的剂量范围，试验开始后连续观察1h，以后每隔1h观察1次，记录蚯蚓的中毒症状和死亡数，拟合回归曲线，测定LC50（半致死浓度）2.2.2 生长抑制率试验 取养殖土（土壤：牛粪=2∶1，共187.5g）放入26個培养盒中，分别加入0、9.375mL、18.75mL、37.5mL、56.25mL的Zn标准溶液（1μg/mL），搅拌均匀，配制为0、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg锌离子浓度的重金属土壤。
除对照组外，各浓度下设置3个平行实验组将15条洗净并称好重量的2种蚯蚓分别加入各组不同锌离子浓度的土壤中，恒温箱养殖，每隔3d挑拣出所有蚯蚓，洗净称重后放回绝对生长抑制率=-[（第n天体重-初始体重）/初始体重]100（n=0，4，8，12，16）相对生长抑制率=实验组绝对生长抑制率-对照组绝对生长抑制率本文所提及生长抑制率皆为相对生长抑制率2.2.3 重金属离子富集实验 测量2月龄蚯蚓在15d内锌离子的富集量，以及相应土壤中的重金属离子浓度将蚯蚓放入烧杯中吐泥2d，用蒸馏水洗净，冰冻致死，于烘箱中70℃烘干24h，冷却后研磨，过20目筛，制成粉备用从每个浓度梯度的土壤中随机选取部分土壤留样，研磨后过目筛，制成粉备用从研磨好的土壤样品中随机选取3份，分别将这3份土壤倒入坩埚放入烘箱中，土壤烘干3d后至恒重，求得土壤平均的含水率为44.60%富集系数=蚯蚓体内重金属含量（mg/kg）/土壤所加重金属含量（mg/kg）[9]2.3 样品消解及锌离子测定 称取土壤样品0.5g、蚯蚓样品0.25g置于不同试管中，少量水润湿土壤样品加入已经配置好的王水10mL，蚯蚓样品加王水5mL，震荡摇匀后，沸水浴（100℃）消解2h，中途摇动1次，取下冷却后，用滤纸过滤至烧杯。
将过滤得到的样品转移至100mL容量瓶，加水定容后，转移至棕色瓶贴标签备用[10]本研究采用二硫腙分光光度法测定锌离子浓度[11]锌离子可与二硫腙在弱酸性溶液中形成红色配合物，能溶于四氯化碳溶液保持原来颜色不变铜、汞、铅等金属离子也可与二硫腙作用，可控制pH值4.5～5.0，并用硫代硫酸钠作掩蔽剂排除干扰取棕色瓶中样品各10mL，分别以稀氨水2mL调节其pH至4.5～5，转移至分液漏斗中依次向分液漏斗中加入HAC-NaAC缓冲溶液5mL、硫代硫酸钠（25%）溶液1mL、二硫腙四氯化碳溶液（0.005%）5mL，震搖2min，静置，取下层有机溶液于比色皿，以四氯化碳溶液为空白组，用723型紫外分光光度计在520nm波长下测量萃取液的吸光度，记录数据比照标准工作曲线，带入线性回归方程，分别计算土壤和蚯蚓体内锌含量3 结果与分析3.1 急性毒性 由表1可知，赤子爱胜蚓的死亡率为0时，土壤中锌离子的浓度为100mg/kg;赤子爱胜蚓的死亡率为100%时，土壤中锌离子的浓度为1200mg/kg太平二号蚓死亡率为0时，土壤中锌离子的浓度为200mg/kg，太平二号蚓死亡率为100%时，土壤中锌离子的浓度为800mg/kg。
对锌离子浓度和存活数进行直线回归，根据回归方程计算得赤子爱胜蚓的LC50数值在800～1200mg/kg，太平二号蚓的LC50数值在400～800mg/kg3.2 生长抑制率 由表2可知，太平二号在刚刚进入含有一定Zn2+的土壤时，受到影响，但由于时间较短，未受到显著影响，呈现先下降再回升的趋势，但从培养后的第10天开始，培养在含有Zn2+土壤中的太平二号体重急剧下降，受Zn2+浓度影响较大，但由于太平二号本身对于其生长环境具有适应性，故从第12d开始，T-100、T-200组中的太平二号因没有受到不可逆伤害，从而体重下降速率减缓，有适应环境的趋势，T-100组的体重甚至开始回升当赤子爱胜蚓刚刚进入含有一定Zn2+的土壤时，受到重金属胁迫无法正常生长，体重大幅下降，从第10天开始，赤子爱胜蚓有适应环境的趋势，故体重稍有回升，其中C-200组尤为显著当锌离子浓度过高时，不可逆伤害效应显现，从第14天开始生长状态变差，体重彻底下降，短期内无法回升3.3 蚯蚓对重金属的富集效应 由表3可知，对照组土壤与蚯蚓中均含有一定量的锌，说明试验所用土壤中本就含有锌，且试验土壤中的锌分布并不均匀当环境中锌浓度较低时（4 讨论空间自相关性是土壤中金属离子分布的基本属性[12]，即不同区域的土壤中金属离子浓度可能存在巨大的差异。
本试验土壤样品中的锌离子浓度不能完全代表自然环境中锌离子的浓度梯度，自然生境中的实际锌离子浓度需根据具体区域另行测量因此，本研究所得土壤锌离子浓度与蚯蚓死亡率的回归方程在实际使用中不能轻易外推，仅能在本试验设置的锌离子浓度范围内有参考价值本试验中，当Zn2+溶液加入土壤时，易被枯枝以及牛粪吸附，后期处理样品时，枯枝和牛粪会被过滤，导致土壤Zn2+浓度偏低因此，试验中应注意将Zn2+溶液与土壤并充分混匀后再加入牛粪等营养物质，以保证Zn2+在土壤中尽可能地平均分布在样品消解并过滤后，对每组样品取相同体积母液，加水至90mL左右，再调节pH至5.0，而后定容至100mL，以保证各组样品的稀释倍数相同用二硫腙分光光度法时，应加入等体积的缓冲液和掩蔽剂，以使各组在分液时水层的体积一致关于赤子爱胜蚓的相关研究表明，加蚯蚓对土壤中DTPA-Zn含量的影响不大当Zn2+添加质量分数为400mgkg-1时，加蚯蚓显著提高了土壤中DTPA-Zn的含量[13]蚯蚓活动可在一定程度上活化土壤中重金属Zn2+，从而增加土壤中重金属的有效态含量[14]本试验中所有处理中的赤子爱胜蚓和太平二号蚓的体重均随Zn2+浓度的增加而显著降低，与已有研究结论吻合，再次印证了Zn2+污染会抑制蚯蚓的生长，但此结果是否适合其他蚯蚓物种尚需进一步研究。
太平二号生长快，成熟早，寿命长，适应性广，抗病能力强，繁殖能力是我国常见环毛蚓的600倍[15]根据本次试验可以得出，太平二号对Zn2+的富集能力要弱于赤子爱胜蚓，但考虑到其受抑制程度也较弱，且繁殖能力更强，因此推论太平二号蚓将在促进土壤生态修复中更具应用价值5 结论由本次研究可知，二硫腙分光光度法测定蚯蚓及土壤中Zn2+浓度的方法是可行的，但需严格控制变量，以确保最大限度地减小试验操作误差赤子爱胜蚓的LC50值在800～1200mg/kg，太平二号蚓的LC50值在400～800mg/kg;赤子爱胜蚓体重受Zn2+限制的程度低于太平二号蚓;赤子爱胜蚓及太平二号蚓对土壤中均具有一定的富集能力，赤子爱胜蚓对土壤中锌离子的富集量更大参考文献[1]郑凯.赤子爱胜蚓对重金属污染土壤的生态毒理诊断及潜在生物标志物筛选[D].南京：南京大学，2013.[2]戈峰，刘向辉，潘卫东，等.蚯蚓在德兴铜矿废弃地生态恢复中的作用[J].生态学报，2001（11）：1790-1795.[3]宋玉芳，周启星，宋雪英，等.土壤环境。