单击此处编辑母版标题样式,,生物电子显微技术,第五章,SEM,样品制备技术,,第一节,SEM,样品制备技术概述,一、生物样品按含水量分类,,,1.,含水量少的硬组织,,包括：毛发、牙齿、植物花粉、子粒等，昆虫,,的口器、刚毛、鳞毛、卵壳等,,处理过程：清洁表面,→,粘胶,→,喷金,→,观察,,,2.,含水量多的软组织,,包括：动植物器官、组织及细菌、真菌等,,处理过程：取材固定,→,脱水,→,干燥,→,,,喷金,→,观察,,1.,使样品的表面形貌结构保持活体时的近,,似形态,,,所观察的表面要求处理干净2.,对拟研究内表面结构，可采用冷冻断裂,,技术获取一个新的观察面3.,尽可能在样品没变形的情况下除去水份，,,即对样品进行“无损干燥”4.,样品表面应有良好的导电性能和二次电,,子发射率5.,进行细胞化学研究时，要求标记物有一,,定的形态，以便于识别二 样品制备的基本要求,三,,样品制备的一般流程,第二节 样品制备的一般程序,一 样品的前处理,二 样品的干燥,四 样品表面的导电处理,三 样品装台（粘胶）,（一）、样品的前处理一般过程,,,取材→清洗→固定→脱水,,（二）、,SEM,与,TEM,在前处理中的区别,,,1.,样品大，一般,6,～,100mm,2,,,高厚,5,－,10mm,,,对于易卷曲的样品可固定在硬纸板或卡片纸上。
2.,特别注意表面清洁（生理盐水、缓冲液、,,,5%,苏打水、超声波震荡、酶消化）,,,3.,固定时间适当延长，除了戊二醛、锇酸、高,,锰酸钾外做固定液外，还有,Paleace,，,Dalton,,,固定液,,,4.,脱完水时要用进入中间液进行置换一 样品的前处理,（三）思考题,,在,TEM,与,SEM,样品制备过程中，,SEM,制样在脱水后需要进行特殊干燥处理，而,TEM,超薄切片中脱水后无需干燥处理，分析其中原因,从两方面考虑：,,1.,样品块的大小不同2. SEM,与,TEM,成像机理及观察样品的,,特征区域不同二 样品的干燥,（一）、 空气干燥法（自然干燥法 ）,,,1.,基本描述,,将经过脱水的样品，让其暴露在空气中,,使脱水剂逐渐挥发干燥 ，也可直接,(,不脱,,水,),放在干燥器中干燥2.,基本特点,,优点：简便易行、节省时间,,缺点：由于脱水剂挥发时表面张力的作,,用，组织块会而产生收缩变形,,方法,1,：单固定或双固定→脱水→样品置于,100,％的脱水剂中→在空气中自然干燥；,,方法,2,：,固定→（组织导电处理）→浸泡在缓冲液与乙醚的,1,：,1,中,5min→,空气干燥；,,方法,3,：单固定或双固定,→,乙醇脱水,→,浸没于六甲基二硅胺烷,HMDS,中二次每次,15min,→,通风厨干燥,1h,3.,常用方法,（二）、临界点干燥法,(CPD: critical point dryer),1.,基本含义,：,,,临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。
2.,基本特点,,,优点：避免表面张力的影响，较好地保存,,样品的微细结构操作较方便，,,快速,2,～,3,小时即可完成，常用,,缺点：需要特殊仪器设备,---,临界点干燥仪3.,基本概念,,,临界点：,物质的气态和液态两相之间达到相同密度、成为均一流体时的温度和压力的总称此时的温度称为临界点温度，压力称为临界点压力中间剂,：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体4.,常用干燥剂,干燥剂,丙酮、醋酸戊酯,5.,常用中间剂：,,中间剂：把用来置换脱水剂而后又被,,干燥剂所置换的液体试剂：醋酸（异）戊酯、丙酮,,6.,干燥过程：,,固定脱水→转入中间液→移至样品,,室→用液体,CO,2,置换醋酸异戊,,酯 →,CO,2,汽化排气→干燥,7. CO,2,临界点干燥器工作原理,(1),脱水不彻底,,(2),醋酸异戊酯反流,,(3),样表粘有过多醋酸异戊酯,,(4),样品量过多,,(5),样品室温度高，注入,CO,2,困难注入,,,CO,2,量太少,,(6),样品室漏气,8.,临界点干燥失败（不彻底）的原因,样品块过大,组织块几何空间中心位置的,,水份无法经脱水、中间剂置换、,CO,2,置换等过程除去，,,CO,2,也无法完全置换掉中间剂，造成样品内外部由,,液,CO,2,（占,95,％－,97,％）、中间剂醋酸异戊酯,2,－,3,％,,样品中心位置游离态水份,1,－,2,％组成，在充分达到,,CO,2,临界态的,40,－,45℃,，压力,10,－,11MPa,时，样品,,几何中心位置游离态水由液体气化为水蒸汽时,(,液态,,醋酸异戊酯由液体气化为蒸汽时）有表面张力的存在，,,从而使样品有少量变形,,(2),,CO,2,放入或排出时,,,样表压力骤增减,,(3),,生物样品本身性质决定及临界点干燥,,本身的缺陷,造成样品有少量变形,9.,原因分析,：经,CO,2,临界点干燥之后,,的样品仍有少量变形的原因？,,10.,干冰优点,,,(1),有利于微小样品的干燥,,,(2),无需钢瓶，搬运方便,,,(3),能准确放入足够的,CO,2,量,,,(4),夏天使用方便,,,(5),不污染样品,,玫瑰花瓣表面的SEM,,照片(850X)，CPD ( critical,,point dryer)干燥,,玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，风干凝固,,（三）、冰冻干燥,1.,含水样品直接冷冻干燥,,,⑴ 常规,步骤：,,取材→固定→冷冻保护处理→快速冷,,冻→升华（,10,-2,乇）干燥→装台镀膜,,,⑵ 基本特点,：,,无需脱水，不会使样品收缩，较早使,,用的方法。
但花费时间长，消耗液氮,,多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用,.,基本描述,：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程,.,⑴,基本描述,：样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到,,某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂,,一起冷冻并在真空中升华而达到干燥⑵,基本特点：,,,优点：可减少冰晶损伤，且干燥时间短缺点：有机溶剂对样品成分有抽提作用，,,造成部分内含物丢失2.,样品脱水后的冷冻干燥,,氟里昂,TF,冷冻干燥,,固定脱水→置换,(,氟里昂取代酒精,) →,,,冷冻→干燥,,乙醇冷冻干燥法,,固定脱水→冷冻→干燥→升温取样,,乙腈(,acetonitrile,),真空干燥法：,,,基本描述：,CH,3,CN,，甲基氰，气化热很大，,,冷却后会固化、升华，利用乙腈在急速,,蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥一般流程：,,固定漂洗→乙腈脱水,→,渗透→升华干燥,⑶常用方法,,氟里昂,TF,冷冻干燥,乙腈真空干燥法,（四）、从高熔点的有机材料中干燥,1.,基本描述,：选用高熔点的有机材料作为升华介质，既可以保留冷冻干燥的优点，又可以不对样品进行冷冻处理，无冷冻损伤，还简化操作。
⑴,、莰烯干燥法,（,1971 Wattens.Buk,）,,取材双固定清洗脱水→置换,(100,％苯脱脂、苯和环氧丙烷,1:1,、纯环氧丙烷每次,15min) →,过渡,(,莰烯,40-45℃,和环氧丙烷,1:1)→,加纯莰烯,45℃,，,20min→,升华真空干燥→装台镀膜观察,,2.,基本方法,：,,⑵,,叔丁醇干燥法,,,取材固定清洗→乙醇脱水,→,样品在,100,％乙醇与叔丁醇的,3,：,1,、,1,：,1,、,1,：,3,、纯叔丁醇中各,10min,→,,纯叔丁醇,4℃,凝固 →真空干燥→镀膜观察,,2.,基本方法,：,三 样品装台,(,粘胶,),（一）、导电胶,,适于：样品块大的组织块，能用较,,大的工具操作,,类型：银导电胶，碳导电胶,,（二）、双面胶带,,适于：细小颗粒（粉末、纤维、,,薄片）,,类型：碳双面胶带、铜、塑料片基,离子溅射（导电处理）的,作用,:,,1.防止样品损伤和荷电效应,,2.增加二次电子发射率，改善图像质量,,3. 即排除原子序数效应的干扰导电处理的一般,方法,：,,,1. 金属镀膜法,,,,2. 组织导电法,,四,,样品表面的导电处理,离子溅射镀膜法,,真空镀膜法,,样品荷电,,效应说明图,Au,C,1. 概念,：采用特殊装置将电阻率小的金属(,Au,Pt,Ag,Pd),离子溅射或真空蒸发后覆盖在样品表面的方法。
2. 作用：,,(1) 消除荷电效应，提高二次电子发射率,,增加信噪比，提高图像反差,;,,(2) 提高样品表面的机械强度，增强样,,品耐受电子的轰击能力,;,,(3) 防止来自组织内部的信息参与成像一）、金属镀膜法：,3. 对金属膜的要求,,(1)膜的厚度要均匀,膜要薄,20,nm,左右,,(2)膜本身无结构，或结构很细微,,(3)二次电子发射率要高,,(4)耐电子束的轰击，化学稳定性好,,4.具体方法,,,A.,离子溅射镀膜法,,,(1)离子溅射,：,,在低真空中进行辉光放电时，阴,,极物质有飞散的现象2) 离子溅射仪的作用,：,,离子溅射（0.01~0.1,Torr,）,,离子蚀刻（要求高真空，高电压条件）,(3)离子溅射仪构造,：,,,① 真空部分,:,真空泵、真空钟罩、真空表、,,进气阀,,,② 溅射部分,：,,,﹡,金属靶：溅射时做阴极,蚀刻时做阳极,,（金属:,Au,Pt,Pd),,﹡样品台：溅射时阳极，蚀刻时阴极,,﹡靶台距离调节器：,,,③ 控制部分,：电压调节器、电流表、定,,时器，阳极阴极转换器,A.,离子溅射镀膜法,(4) 离子溅射仪工作原理,,放入样品→抽真空→加高压→产生电场→残余气体分子电离→正粒子轰击金属靶→激发金属颗粒→金属颗粒依附于样品表面→金属膜形成,A.,离子溅射镀膜法,①,溅射出来的金属颗粒小,,,镀膜质地精细,,②,镀膜薄厚均匀,,③,,膜片厚度容易控制,,,不掩盖样品表面结构,,,,节省金属材料,,④,膜片附着力强,,⑤,受辐射热影响较小，对样品的损伤小。
⑥,所需真空度低，节省时间,,⑦,金属粒子能够进入到样品表面的缝隙,,和凹陷处，对于表面凹凸不平的样品,,也能形成很好的金属膜,A.,离子溅射镀膜法,（,5,）离子溅射镀膜的特点,(1) 原理:高真空下,使某些金属物质加热到熔点,,以上,真空蒸发成极细的颗粒沉积到样,,品表面,在样表形成薄金属膜.,,(2)仪器:真空喷镀仪(10,-5,Torr),B.,真空镀膜法,5.,离子溅射法与真空镀膜法比较,项目,离子溅射法,真空镀膜法,适宜真空度,低,0.01-0.1torr,高,10,－,5,能否喷碳,不能,能,镀膜附着力,强,弱,膜厚度控制,容易,较难,SE,获取量,较多,一般,样损伤程度,小,较大,样品污染,黑化污染,无,1.,定义：,,,组织导电法,:利用重金属盐溶液对生物体的蛋白质、脂肪及淀粉等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能很好的金属化合物，从而提高样品耐受电子轰击的能力和导电率2.,导电液应具备的条件,：,,(1) 能对组织染色 (2)组织结构保存完好,,(3) 不污染样品 (4)不掩盖样品超微结构,,(5) 导电性能好，消除荷电效应,,(6) 二次电子发射率高，亮度大,,,图像反差强,(,二,),、组织导电法,(,导电染色,),3,、常用处理方法,,(1) 碘化钾,-,碘导电染色法,：,,碘化钾20,g+,碘0.2,g+,双蒸水100,ml＋2.5%,,,戊二醛10,ml+,葡萄糖0.2,g,,,(2) 碘化钾－醋酸铅导电法,,A,液：碘化钾 20,g,,,碘0.2,g,,加双蒸水100,ml,,B,液：氢氧化钾4,g,,醋酸铅1.2,g,加水至100,ml,,用时需稀释，1分母液＋3分水,（3）,.,丹宁酸---锇酸导电法:,第三节,,特殊样品制备技术,一、直接观察法,二、活体观察法,六、样品的割断法,七、蚀刻法,八、铸型技术,三、粘贴镀膜观察法,四、熏蒸固定观察法,五、石蜡组织切片观察法,九、树脂包埋的样品,SEM,观察法,一、直接观察法,2.,适用范围,:,适合于低倍条件下,,,观察含水量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率要求不高的样品,.,4.,适用样品,:,植物干标本,,,干种籽,,,干果、果壳,,,竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、金属等,3.,基本步骤,:,取材→风洗水洗后风干或不洗→粘样→常压或低压观察,1.,基本描述,:,样品不经过任何处理,,,直接粘贴到样品托上入镜观察,二、活体观察法,1.,基本描述,：,,利用样品本身具有的导电和产生二次电子的,,能力，直接观察一些体积较小、含水分不多,,的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。
其,特,,点,是：可观察生物活体形态结构和生活状态，,,图像表现真实，没有变形或人为附加结构2.,基本要求,：,⑴ 限制昆虫的爬行和跳跃，用胶带限制其活动⑵ 样品体积尽可能小；,,⑶ 低压观察常用,2,－,5Kv,，最大,10Kv,；,,⑷ 操作熟练，迅速观察尽早摄影,3.,基本步骤,：,,取材→清洗或不洗→胶带粘样→,,常压或低压观察,4.,适用样品,：,,螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、,,被粘牢固的昆虫或其器官,三、粘贴镀膜观察法,1.,基本描述,：,,样品只进行粘贴、镀膜即可其,特点,：常压观察下获得高分辨率高,,放大倍数图像2.,适用范围,:,,适宜,,观察表面细微结构丰富、 含水量,,少的、形态比较固定或不宜进行脱水或,,干燥的样品本方法解决了样品的导电率,,及二次电子发射量的问题，可以常压下观,,察高倍率、高分辨率图像,3.,基本步骤,：,,取材→粘样→镀碳（样品表面凹凸变化大的可先喷镀碳层）→金属膜 →常压观察,4.,适用样品,:,,成熟的孢子、花粉，生活状态的菌体、菌落，尘埃、微小颗粒，丝绒、毛发，表面凹凸变化大的样品，如昆虫体表等四、熏蒸固定观察法,1.,基本描述,：粘贴后的样品放置于密闭容器中，用熏蒸法进行固定，经镀膜或不镀膜即可观察。
其,特点,：该方法适合“不宜在液体中处理样品”，蒸汽固定剂为,1,％－,2,％的锇酸，全部操作在通风橱进行，高倍观察时还应离子溅射镀膜2.,基本步骤,:,取材→粘样→熏蒸固定,(10-30min)→,镀膜或不镀膜→常压或低压观察,3.,适用样品,:,固定培养基上的培养物，用于研究培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然状态、菌丝的生长，孢子的形成等五、石蜡组织切片观察法,1.,基本描述,：对动植物的石蜡切片进行适当处理，放在,SEM,下观察其,特点,：图像分辨率高、景深大立体感强，制样简单、成本低、时间短2.,基本步骤,：光镜定位→切片→贴台→脱蜡,(,二甲苯,,3-5min,后滤纸吸附溶解物，反复,3-5,次,)→,镀膜,(,或不镀膜,)→,观察,3.,适用样品,：一切组织的石蜡切片都适用，但对已经封固或加盖片的不能用六、样品的割断,（一）,,树脂割断法,1.,环氧树脂冷冻割断法,：,,取材修样(,1＊1＊5mm),→固定脱水→,,包埋置换→固化→割断样品→脱树脂,,→临界点干燥→装台粘胶,,2.,苯乙烯树脂割断法,⑴,特点,:,,a.,包埋的树脂已聚合,,,可长期保存,,,b.,割断时在室温下进行,,,c.,易割断较硬的组织,(,骨骼,,,结缔组织,),,,⑵,,步骤,：,,取材固定脱水→置换→包埋→聚合→割,,断→脱树脂→醋酸异戊酯置换→临,,界点干燥→装台粘胶,,1.,无水乙醇冷冻割断法,:,,,优点:制作时间短,不易弄脏容器,,步骤:取材固定脱水→100%乙醇包埋→冰,,冻固化→冷冻裂断→融化乙醇→临界点,,干燥→装台粘胶,,2. 70%,乙醇冷冻干燥,,特点:经济简单,但不能人为确定断裂面,,步骤:准备→冷冻→自然断裂→冷冻干燥,,→装台→喷金,(,二,),有机溶媒割断法,方法,:,,(1),刀切,,,(2),镊子掰开,,,(3),双面胶带法,,,(4),液氮冷冻割断,(,三,),干燥样品的割断,七、蚀刻法,1.,酶蚀刻法,,利用酶的作用使细胞的一部分物质,,被蚀刻去掉,,,从而清楚的显示出另,,外一部分结构。
如：利用链霉蛋白酶,(prorase),处理小麦的胚乳细胞，把包在外面的细胞去掉，以观察淀粉的结构2.,离子蚀刻法,,使用离子溅射仪进行辉光放电时，用高速的阳离子冲击样品表面，剥离掉样品的成分，暴露样品内部细微结构如：用该方法可以看到白细胞、胰脏外分泌细胞的核表面结构，清楚看到核孔的分布状况八、铸型技术,,,1.,概念：,,为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术2.,常用的铸型剂：,,甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及,ABS,等ABS,是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，是理想的铸型剂3.,用,ABS,制作血管铸型样品的一般步骤,⑴ 灌流和注入铸型剂,,⑵ 腐蚀和清洗,,⑶ 显微解剖和剥制铸型,,⑷ 干燥和镀膜,九、环氧树脂包埋的样品,SEM,观察法,1.,基本描述,：环氧树脂包埋的样品切成半薄切片或超薄切片后，再将环氧树脂除去，在,SEM,下观察研究，可以对样品的细胞结构进行多种综合研究，得到更多的信息2.,常用溶剂,：,氢氧化钠饱和乙醇（或醚类、丙酮）容易可以溶解已经聚合的环氧树脂，将,NaOH,溶解于乙醇，饱和（,2,％－,4,％），放置,2,－,3,天，在此过程中产生氧自由基，溶液颜色由浅褐色变成金棕色，氧自由基可以打断环氧树脂和酸酐间的酯连接，溶解环氧树脂。
也可用,NaOH,的冠醚溶液3.,操作步骤,：,⑴ 解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分⑵,将组织块（或切片）放入合适的容器中，,,其中加入溶解液,NaOH,的乙醇溶液,5,－,10ml,1-4h,,⑶ 样品取出放入绝对乙醇,(,或冠醚,),中彻底清洗组织,,⑷ 临界点干燥,,⑸ 粘胶镀金属膜并观察作业,1、名词解释：临界点 离子溅射 中间剂,,组织导电法,铸型技术,,2、SEM,样品制备中，需要对样品进行干燥处理，,,而在,TEM,样品处理过程中只须对样品脱水处,,理，试分析其原因3、SEM,与,TEM,的样品前处理过程中操作方法有,,何异同4、制备,SEM,的样品有那些干燥方法？,,5、试简述临界点干燥仪的结构及其工作原理，,,临界点干燥的主要步骤6、临界点干燥仪中，使用干冰做干燥剂有何优点7、样品表面的导电处理方法有那些？,,金属镀膜法的作用如何？对金属膜,,有何要求？,,8、什么是组织导电法？对样品进行组织导,,电处理后，是否需要进行喷涂黄金,,层？组织导电液应具备的条件？,,9、简述离子溅射仪的工作原理、离子,,溅射仪镀膜的特点，与真空镀膜法,,相比较它有什么优点？,陆地面花粉粒的剥离观察,花粉萌发孔形态,甘蓝型油菜花粉观察,花粉内壁原生质体的表面,向日葵花粉观察,蓖麻,普通小麦,水稻,菠菜与萝卜,大麦花粉,蜀葵,木槿,管道破裂口形貌,破裂口附近内壁表面结构,钢铁组织形态观察,图a为一碳钢在,,退火状态下得到,,的珠光体的二次,,电子像,,图,b,为用2%硝酸酒精腐蚀后的铸铁组织的二次电子,,图,c,为含碳钢高温淬火后得到的马氏体组织的二次电子像,图,a,解理台阶 图,b,羽毛花样,主要参考图谱,1.《组织细胞冷冻复型电镜图谱》,,人民卫生，李文镇，1981,,2.《植物花粉剥离观察扫描电镜图解》,,科学出版，蓝盛银，1996,,3.《细胞生物学超微结构图谱》,,高等教育，汪德耀，1989,,4.《医学生物学电子显微镜图谱》,,科学出版，中国医学科学院，1978,,5.《金相图谱》，水利电力，1986,。