实验三紫外线的诱变育种（学时：4）一、目的要求通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法二、基本原理紫外线对微生物有诱变作用，主要引起的是DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异三、菌种与仪器菌种：枯草芽孢杆菌；仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机四、操作步骤1. 菌悬液的制备A、取培养48小时的枯草芽抱杆菌的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块B、将上述菌液离心（3000r/min,离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液C、用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个2•平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55°C左右时倒平板，凝固后待用3.紫外线处理A、将紫外线灯开关打开预热约20分钟B、取直径9cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml,并放入无菌搅拌棒于平皿中C、将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
4•稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）5•涂平板取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml,用无菌玻璃刮棒涂匀以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照6•培养将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置7C培养48小时注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度7•计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率左午您处理后每澆升活菌数X100致死率=对照每毫升活菌数-刘理后每毫升活菌数X1008.观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养此斜面可作复筛用五、实验结果（将实验结果填入下表）倍数\平均菌落\处理时数/皿）10-410-510-6存活率％致死率％诱变剂（min)紫外线0（对照）1(UV)2\结果\处理透明圈和菌落直径大小、（mm）及其HC比值123456透明'圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值透明圈菌落HC比值UV处理对照六、思考题1. 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？2. 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？。