实验二氨基酸的分离鉴定一一纸层析法【实验目的】1•学习氨基酸纸层析法的基本原理2•掌握氨基酸纸层析的操作技术【实验原理】纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术， 可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、 糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具纸层析法是用滤纸作为惰性支持 物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相在 层析时，将样品点在距滤纸一端约2〜3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层 析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd） 不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值 （rate of flow, Rf）来表示所谓Rf,是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层 析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：肛一原点至层析点中心的距离 X#I原点至溶剂前沿的距离-=〒在一定条件下某种物质的Rf值是常数Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、 湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
器材与试剂】（一）器材1•层析缸2•点样毛细管3•小烧杯4. 培养皿5. 量筒6•喷雾器7.吹风机（或烘箱）8•层析滤纸（新华一号）9•直尺及铅笔（二）试剂1. 扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸混合液）将正丁醇和乙酸以体积比4 : 1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5 : 3与蒸馏 水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂2. 氨基酸溶液0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）3. 显色剂0.1%水合茚三酮正丁醇溶液实验步骤】1.准备滤纸取层析滤纸（长22 cm、宽14 cm） —张，在纸的一端距边缘2〜3 cm处用铅笔划一条直线, 在此直线上每间隔3 cm作一记号，如右图所示2•点样用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2〜3次每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm3扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触将盛有约 20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将 滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液 面需低于点样线1 cm）待溶剂上升15〜20 cm时即取 出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹 风机热风吹干。
4. 显色用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用吹风机吹干或者置烘箱中Q00°C ）烘烤 5min即可显出各层析斑点5. 计算计算各种氨基酸的Rf值要点提示】1•取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条 件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸要将滤纸平放在洁净的纸上，不可放在实验台上，以 防止污染2•点样点的直径不能大于0.5 cm,否则分离效果不好，并且样品用量大会造成“拖尾巴”现 象3•在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点要高于培养皿中扩展剂液面约1cm由于各氨 基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从滤纸一 端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组分分离思考题】1•纸层析法的原理是什么？2•何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？。