实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳目的要求（1） 了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术2） 测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量原 理醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持 物它是纤维素的酷酸酯，由纤维素的轻基经乙酰化而成°它溶于丙酮等有机溶液中，即可 涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1—一0.15mm为宜太厚吸水性差，分离效果不好; 太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生 产的薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点：（1） 酷酸纤维薄膜対蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色, 各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测量的精确性2） 快速省时由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲溶液也较 少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般 电泳45——60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
3） 灵敏度高，样品用量少血清蛋白电泳仅需2mL血清，甚至加样体积少至L,仅含5ug蛋白样品也可得到清晰的分离区带临床医学检验利用这一特点，检测在病 理情况下微量异常蛋白的改变4） 应用面广某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、 组蛋白的等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离5） 酷酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明 的干板，有利于扫描定量及长期保存Ftl于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉目前己广泛用于分析检测血浆蛋白、脂 蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髄液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子, 为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验 的常规技术本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白血清中含有清蛋白，a-球蛋 白、B-球蛋白、丫-球蛋白和各种脂蛋白等各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子 塑、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同分子量小、等电点低、在相同碱性PH值 缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快例如，以醋酸纤维素薄膜为 支持物，正常人血清在PH8. 6的缓冲体系中电泳lh左右，染色后可显示5条区带。
清蛋白 泳动最快，其余依次为u厂02-, 及丫-球蛋白（如图2.1）o这些区带经洗脱后可用分 光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比临床医学常利 用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据此法由于操作简 单，快速，分辨率高及重复性好等优点目前，已成为临床生化检验的常规操作之一它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定图2. 1正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1为清蛋白，2, 3, 4, 5分别「-，a2-, [3-及丫-球蛋白，6为点样原点试剂和器材一、 测试材料未溶血的人或动物血淸二、 试剂1. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（PH8.6, 0. 07mol/L,离子强度0. 06）称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR）,置于三角烧瓶中，加蒸镭水约600mL, 稍加热溶解，冷却后用蒸馄水定容至lOOOmLo置4°C保存，备用2. 血清蛋白染色（1） 染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B,加蒸帼水40mL,甲醇（AR） 50mL,冰乙酸（AR） 10mL,混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。
2） 漂洗液：取95%乙醇（AR） 45mL,冰乙酸（AR） 5mL和蒸馆水50mL,混匀置 具塞试剂瓶中贮存3） 透明液：临用前配制甲液：取冰乙酸（AR） 15mL,无水乙醇（AR） 85mL,混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞， 备用乙液：収冰乙酸（AR） 25mL,无水乙醇（AR） 75mL,混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞， 备用4） 保存液：液体石蜡5） 定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸镭水溶 解后定容至1000ml o三、器材酷酸纤维素薄膜（2X8cm）,培养皿（直径9一一10cm）,解剖铁子竹夹子，点样器, 直尺和铅笔，电泳仪及电泳槽，玻璃板（12X12cm）,试管若干及试管架，吸量管（2mL, 5mL）,可见光分光光度计，吹风机，单面刀片，普通滤纸及臭氧化缸（可用普通容器代替）操作方法一、仪器与薄膜的准备1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用竹夹子取一片薄膜，小心地平放在盛有缓冲液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15 —30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色 泽深浅不一或有条纹及斑点等，则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结果。
将选好 的薄膜用竹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后，方可用于电泳2. 电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条在两个电极槽中，各倒入等体积的 电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对 齐，另一端浸入电极缓冲液内当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸 以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的 桥梁，因而称为滤纸桥3. 电极槽的平衡用平衡装置（或口制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一 水平状态，一般需平衡15——20min注意，取出平衡装置时应将活塞关紧二、点样1. 制备点样模板取一张干净滤纸（lOXIOcm）,在距纸边1.5cm处用铅笔划一平行线，此线为点样标志 区2 •点样用竹夹子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液无光泽面向上平放在 点样模板上，使其底边与模板底边对齐点样区距阴极端1.5cm处点样吋，先用玻璃棒或 血色素吸管取2-3PL血清，均匀涂在加样器上，再将点样器轻轻印在点样区内，如图2.2 所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。
此步是实验的关键，点 样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样 图2. 2醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 虚线处为点样位置三、电泳图2.3电泳装置剖视示意图1 •纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电极室中央隔板用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平 贴在阳极端支架上，如图2.3所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂如一电泳 槽中同时安放儿张薄膜，则薄膜Z间应相隔儿毫米盖上电泳槽盖，使薄膜平衡lOmino用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错在室温下电 泳，打开电源开关，用电泳仪上细调节旋扭调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA （8片薄膜则 为4.8mA）通电10-15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8 mA）, 电泳时间约50-80mino电泳后调节旋扭使电流为零，关闭电泳仪切断电源四、染色与漂洗1.血清蛋白染色与漂洗脱色用解剖银子取岀电泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min, 取出后再用漂洗液浸洗脱色，每隔lOmin换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脫尽。
取 出薄膜放在滤纸上，用吹风机的冷风将薄膜吹干 <+)清蛋白a厂at厂疔-y■球蛋白原点廿脂蛋白前沪0-脂蛋白乳糜微粒 脂蛋白图2.4血清蛋白与脂蛋白酷酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图a.蛋白染色b.脂蛋白染色五、透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡lmin,取出后立 即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡，约2-3min薄膜完全透明若透明太慢可用滴 管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无 酸味再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角, 用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min, 再用滤纸吸干液体石蜡，压平此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描长期保 存不褪色六、结果判断与定量一般血清蛋白电泳经蛋白染色后，可显示5条区带，其排列顺序见图2.4a,未经透明处 理的电泳图谱可直接用于定量测定可采用洗脱法或光吸收扫描法，测定各蛋白组分相对百 分含量注意事项1.醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。
将干 膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15-30S时，膜片吸 水不均匀，则有白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后区带 扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复由于酷酸纤维素薄膜亲水性比纸小，浸泡 30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构最好是让 漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶走点样吋, 应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散但也不能吸得太干, 太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果吸水量以 不干不湿为宜为防止指纹污染，取膜时，应戴指套或用夹子2. 缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥缓冲液，其浓度为0.05-0.09mol/Lo选择何 种浓度与样品及薄膜的厚薄有关在选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜 长度为8—10cm,则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4—0.5mA/cm膜宽当电泳时达不 到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快, 并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。
3. 加样量加样品量的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关作为 一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利如加样量过大，则电泳后区带 分离不清楚，其至互相干扰，染色也较费时如电泳后用洗脱法定暈时，每厘米加样线上需 加样品10.-5 UL,相当于5—1000 ug的蛋白，血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加 样量不超过1UL,相当于60—80 u g的蛋白质但糖蛋白和脂蛋白电泳吋，加样量则应多 些对每种样品加样量均应先作预实验加以选择点样好坏是获得理想图谱的重耍坏节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能 太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果4. 电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4-0.5mA/cm宽膜为宜电流强度 高，则热效应高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白变性或由于热效应引起缓冲液中水 分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散5. 染色液的选择对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择其原则是染料对被分离样品 有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋 酸纤维素薄膜溶解C应控制染色时间。
时间长，薄膜底色深不易脱去；时间太短，着色浅不易区分，或造成 条带染色不均匀，必要时可进行复染6・透明及保存透明液应临用前配制，以免冰乙。