第十三章 DNA的复制和修复生物体的遗传信息储存在DNA中，并通过DNA的复制 由亲代传给子代 在子代的生长发育中遗传信息自DNA转录给RNA，然 后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现 出与亲代相似的遗传性状 基因性状：one geneone enzyme hypothesis.1958年，F.Crick提出中心法则： （1）以原DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程 （2）以某一段DNA分子为模板，合成出与其序列对应的RNA分 子的过程 （3）以mRNA为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的 过程中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向DNA生物合成有两种方式：DNA复制和反 转录DNA体内复制涉及：原核、真核生物的染 色体、细菌质粒（环状，双链）、真核 细胞器DNA（线粒体、叶绿体）、病毒 （双链，环状） DNA的体外复制：分子克隆 第一节 DNA的复制 一、 DNA半保留复制1953年，Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时就推测 DNA可能按照半保留机制进行自我复制 P321 图191 Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在 其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代DNA与亲代 DNA分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代DNA分子中有 一条链完全来自亲代DNA，另一条是新合成的。
1958年，Meselson和Stahl用15N标记E.coli. DNA，用密度梯度离 心试验证明了DNA的复制是半保留复制 P322 图192 DNA的半保留复制1963年，Cairns用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的 正在复制的E. coli. 染色体DNA P323 图 1933H脱氧胸苷标记E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消 化细胞壁，将E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H 放出β粒子，还原银，在光学显微镜下观察用这种方法证明 了大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子，并以半保留的形式 进行复制DNA的半保留复制可以说明 DNA在代谢上的稳定性经过 多代复制，DNA的多核苷酸链 仍可以保持完整，并存在于后代 而不被分解掉 二、 复制起点、单位和方向DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会 继续下去直到整个复制子完成复制 1、 复制起点复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列有时， 两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环复制 ）在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成 一次复制过程。
多数生物的复制起点，都是DNA呼吸作用强烈（甲醛变性实验 ）的区段，即经常开放的区段，富含A.T★环状DNA复制起点的gene mapping P325 图196★复制起点的克隆和功能分析——重组质粒转化法 大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行 为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有12个拷贝 ，用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小，最后得到245bp的 基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以 增加到20以上，这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区 ，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间 鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上，与大肠杆 菌的复制起始区有86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细 菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用因此，复制起始 区的结构可能是很保守的 起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序 列 2、 复制单位 复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每 个复制子都含有一个复制起点 原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都 是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固 定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少 数是单向复制。
多数是对称复制(θ形复制)，少数是 不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制, 如D环复制） 真核生物的染色体DNA是线形双链分子，含有许多复 制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100 200Kbp人体细胞平均每个染色体含有1000个复制 子 病毒DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都 是单复制子 3、 复制方向 大多数是双向的（等速进行或异速进行），形成两个 复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度P325 图1917 单向和双向复制的放射自显影证明低放射性3H脱氧胸苷 高放射性3H脱氧胸苷a. 单向b. 双向等速 c. 双向异速E.coli.的一个温度敏感株，在42℃时，能使DNA在完成复制后， 不再开始新的复制过程，而在25℃时复制功又能能恢复 4、 DNA的几种复制方式 （1）、 直线双向复制单点双向，T7 多点双向，真核染色体DNA （2）、θ型复制：环状双链DNA，对称复制，单向或双向（E .coli.） （3）、 滚环复制：环状单链DNA，Φx174 （4）、 D环复制（取代环复制）：不对称复制，线粒体、叶绿体DNA。
两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持 单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链 的复制起点，另一条链才开始复制5）、 多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制DNA复制时复制叉前进的速率比较恒定，DNA复制的速率实际上 取决于起始频率 E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟 [4.2X106/（50KbX2）=42]富营养时，可采取多复制叉复制方 式，20min复制一代 真核复制叉前进的速率约10003000bp/min，采用多复制子方式， 真核染色体复制一代要68小时 三、 与DNA复制有关的酶及蛋白质因子 目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复 制 （一） DNA聚合酶和DNA的聚合反应DNA生物合成5，→3，，化学合成3，→5， 1、 DNA聚合反应必备的条件⑴ DNA聚合酶 ⑵ DNA模板(反转录时用RNA模板) ⑶引物 (DNA、RNA或蛋白质) ⑷ 4种dNTP ⑸ Mg2+2、 聚合反应过程及特点总反应式： n1dATP DNA pol . dAMP n2dGTP +DNA dGMP DNA+（ n1+n2+n3+n4）PPi n3dCTP Mg2+ dCMP n4dTTP dTMPP329 图1910 P330图1911在链的延长过程中，链的游离3，羟基，对进入的脱氧核糖核苷 三磷酸α磷原子发生亲核攻击，生成3，.5，磷酸二酯键，并脱 下焦磷酸。
DNA聚合酶的反应特点 ： ⑴ 以4种dNTP为底物 ⑵ 反应需要接受模板的指 导，不能催化游离的dNTP 的聚合 ⑶ 反应需有引物3，羟基存 在 ⑷ 链生长方向5， → 3， ⑸ 产物DNA的性质与模板 相同3、 由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型P331图1912 （1） 发荚环结构：加入单链DNA作为模板和引物，3＇羟基端 回折成引物链 （2） 末端延伸聚合：加入双链DNA作为模板和引物，3’末端 突出作为模板 （3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链DNA，聚合发生在 切口或末端单链区 （4） 环形聚合：加入带引物的环形DNA作为模板4、 E.coli DNA聚合酶（1）、E.coli. DNA pol. I（Kornberg酶，400 copy/cell） 单体酶，分子量109Kd，含一个Zn2+，每个细胞中含400个DNA pol.Ⅰ催化活性： 5， → 3， 聚合活性 3， → 5， 外切活性 5， → 3， 外切活性 用蛋白水解酶将DNA pol.Ⅰ部分水解可得： 大片段（Klenow），75Kd，活性：5， → 3，聚合活性、3， → 5，外切活性。
小片段，36Kd，活性：5， → 3，外切活性（只作用于双链DNA的碱基配对部 分，切除修复） Klenow片段的用途： a 补齐DNA 3，隐缩未端 b. 标记DNA片段未端 c．cDNA合成第二链 d．d DNA测序（2）、 E.coli. DNA Pol.Ⅱ（100 copy/cell） 单体酶，分子量120Kd 催化活性：5，→ 3，聚合(活性很低)3，→ 5，外切 可能在DNA的修复中起某中作用 （3）、 E.coli.DNA pol.Ⅲ（复制酶，10-20 copy/cell ） 寡聚酶，全酶由10种共22个亚基组成，α、ε和θ三种亚 基组成核心酶 P334表103DNA pol.Ⅲ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶 (Replicase) Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于单链DNAP334 表192 E.coli三种DNA聚合酶的性质比较★DNA聚合酶有6个结合位点⑴ 模板DNA结合位点⑵ 引物结合位点⑶ 引物3，OH位点、反应位点⑷ 底物dNTP结合位点⑸ 5， → 3， 外切位点(pol.Ⅱ没有)⑹ 3， → 5， 外切位点(校正)5、 真核生物DNA聚合酶 P334 表194 真核生物DNA聚合酶真核DNA聚合酶一般不具备外切活力，可能由 另外的酶在DNA复制中起校正功能。
⑴ DNA聚合酶α，多亚基，功能与E.coli. pol.Ⅲ类似，是真核DNA复制酶⑵ DNA聚合酶β，主要在DNA损伤的修复中起 作用⑶ DNA聚合酶γ，从线粒体得到，可能与线粒 体DNA的复制有关⑷ DNA聚合酶δ，特点：有3， → 5，外切活力（二） 引物酶或RNA聚合酶（引发酶） 细胞内，DNA的复制需要引物（DNA或RNA） ，引物酶或RNA聚合酶可合成610个碱基的 RNA引物 ★DNA复制为什么要用RNA引物？（为什么 DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引 物？） P338 ⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和 氢键都较弱，易发生错配 ⑵新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成 稳定双链，DNA聚合酶的5，→3，校对功能难 发挥作用 （三）、 解螺旋酶 大肠杆菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ与rep蛋白共同 作用，将DNA两条链解开 解螺旋酶I、II、III沿着模板链的5’→3’方向随着 复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条 模板链上沿3’→5’方向移动 （四） DNA旋转酶 属DNA拓扑异构酶Ⅱ，可引入负超螺旋，消除 复制叉前进时带来的扭曲张力 拓扑异构酶分两类：I和II，广泛存在于原核生 物和真核生物。
拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接 ，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区 ，与转录有关 拓扑异构酶Ⅱ使DNA的两条链同时断裂和再连 接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量 分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有 关 （五） 单链DNA结合蛋白（SSB） 复制叉上的解螺旋酶，沿双链DNA前进，产生 单链区，大量的单链DNA结合蛋白与单链区 结合，阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶 降解 （六） DNA连接酶（ligase）连接双链DNA上的切口 大肠杆菌连接酶只能在模板上连接DNA缺口T4DNA ligase即可 连接粘性末端的DNA，又可连接平齐末端的双链DNA E.coli.和其它细菌的DNA ligase以NAD为能源，动物细胞和噬菌 体DNA ligase以ATP为能源 （七） DNA复制的拓扑结构P3383。