第八章第八章 HPLC的补充内容的补充内容 液相色谱键合相的类型和色谱液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素性质的主要影响因素 高效液相色谱键合固定相的类型高效液相色谱键合固定相的类型主要有四类：主要有四类：•硅硅-氧氧-碳键型固定相碳键型固定相•硅硅-氮氮-碳键型固定相碳键型固定相•硅硅-氧氧-硅硅-碳键型固定相碳键型固定相•硅硅-碳键型固定相碳键型固定相 1、硅、硅-氧氧-碳键型固定相碳键型固定相制备方法之一：制备方法之一： 高压、过量醇、高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅度条件下与硅胶的硅羟基发生反应羟基发生反应制备方法之二：制备方法之二： 亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应再与过量醇进行醇解反应缺点：容易被水解缺点：容易被水解 2、硅、硅-氮氮-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应对有机溶剂和对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定的水介质稳定 3、硅、硅-氧氧-硅硅-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应硅氧烷进行硅烷化反应 。
对有机溶剂和对有机溶剂和pH=2-8.5的水介质是稳定的的水介质是稳定的 4、硅、硅-碳键型固定相碳键型固定相制备方法：制备方法： 氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应氯化硅胶和有机锂或格氏试剂反应稳定性优于硅稳定性优于硅-氧氧-碳键型固定相，但生成的产碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低物覆盖度较低 键合固定相的性质键合固定相的性质1、表面覆盖度、表面覆盖度完全水解的硅胶表面有完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基，由于位阻硅羟基，由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应，以消除其不良影响参与硅羟基反应，以消除其不良影响表面覆盖度越高，色谱保留越强表面覆盖度越高，色谱保留越强 2、键合相链长的影响、键合相链长的影响对于反相色谱固定相对于反相色谱固定相 键合相链长越长保留越键合相链长越长保留越强强对于正相色谱固定相对于正相色谱固定相 链长的影响不明显链长的影响不明显3、键合固定相基质性质的影响、键合固定相基质性质的影响基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。
覆盖度等，都会对键合相有一定的影响 高效液相色谱的色谱柱和流动相高效液相色谱的色谱柱和流动相 色谱柱色谱柱•HPLC柱填料柱填料1、全多孔球形硅胶填料最、全多孔球形硅胶填料最为普遍普遍硅胶基硅胶基质分分为微孔微孔(小于小于2nm)，中孔，中孔(2-50nm)，大孔，大孔(大于大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料硅胶填料2、其它金属氧化物基、其它金属氧化物基质填料填料TiO2、、Zr O2、高分子聚合物等基、高分子聚合物等基质的填料，的填料，能能够改善耐碱性和减弱硅改善耐碱性和减弱硅羟基效基效应 •硅胶色谱柱填料的优势硅胶色谱柱填料的优势1.1.硅胶有良好的机械强度硅胶有良好的机械强度2.2.硅胶的孔结构和比表面积容易控制硅胶的孔结构和比表面积容易控制3.3.硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性定性4.4.硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰学键合修饰 •硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应•碱性分析物严重拖尾，分离度低碱性分析物严重拖尾，分离度低加入碱性流动相加入碱性流动相添加剂抑制添加剂抑制 •反相色谱柱填料保留性能随温度的变化反相色谱柱填料保留性能随温度的变化lnk’与与1/T在一定温度范围内呈线性关系在一定温度范围内呈线性关系 •提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能1.1.提纯硅胶，利用高纯提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料硅胶色谱填料2.2.对硅胶进行充分封端（尾）对硅胶进行充分封端（尾）3.3.利用空间位阻掩蔽残余硅羟基利用空间位阻掩蔽残余硅羟基4.4.键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基）酰胺基）5.5.双齿键合相双齿键合相 高效液相色谱的流动相高效液相色谱的流动相•常用反相色谱流动相：甲醇常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈水、乙腈-水水•常用正相色谱流动相：正己烷常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正异丙醇、正己烷己烷-乙醇、正己烷乙醇、正己烷-四氢呋喃四氢呋喃•常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠钠•需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。
高效液相色谱方法的选择高效液相色谱方法的选择•反相色谱可以分析多数样品反相色谱可以分析多数样品•极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留极性极强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相水流动相分离•弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离•分析离子，首选离子色谱分析离子，首选离子色谱•生物分子的分离模式有反相、离子交换、生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式 色谱条件的影响色谱条件的影响•色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高小分离度越高•柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（度越大，但柱压越高（5μm到到3μm柱效提高柱效提高30%柱压却升高柱压却升高1倍）•流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。
减弱•流速越高，保留时间越短，但柱压液越高流速越高，保留时间越短，但柱压液越高•柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低柱温越高，保留时间越短，分离度有所降低•在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱峰形时，可以进行梯度洗脱 40度度169bar90度度94bar温度的影响温度的影响 SB-C8 4.6X75mm 3.5um流通池流通池: 5mm, 2.5uL20~60%B (10min.)2mL/min.SB-C8 4.6X150mm 5um流通池流通池: 10mm, 8uL20~60%B (30min.)1mL/min.填料粒径填料粒径的影响的影响 5um色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm3.5um色谱柱尺寸色谱柱尺寸: 4.6 x 50mm填料粒径填料粒径的影响的影响 -CN柱柱-苯基柱苯基柱C8柱柱填料种类填料种类的影响的影响 液相色谱仪器的维护液相色谱仪器的维护 液相色谱仪器的维护和维修液相色谱仪器的维护和维修•流动相需要用流动相需要用0.45μm的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤 微孔滤膜微孔滤膜滤膜种类分为滤膜种类分为过水相过水相和和过有机相过有机相两种两种 •过过滤滤有有机机相相流流动动相相用用有有机机（（聚聚四四氟氟乙乙烯烯））滤膜。
滤膜•过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜过滤水或盐溶液作为流动相用水相滤膜•盐盐溶溶液液作作为为流流动动相相时时，，需需要要先先将将盐盐溶溶解解后后再再进进行行过过滤滤，，不不能能先先过过滤滤完完水水再再溶溶解解盐盐，，防止盐中的固体不溶物堵塞流路防止盐中的固体不溶物堵塞流路•注注意意：：用用于于过过滤滤无无机机流流动动相相的的滤滤膜膜溶溶于于有有机溶剂 •样品需要用样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤 •样品需要用样品需要用0.22μm的微孔滤膜进行过滤的微孔滤膜进行过滤针式样品过滤器针式样品过滤器 •流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过流动相中的固体颗粒和密封圈碎屑会堵塞过滤白头，导致泵压过高，需要及时更换滤白头，导致泵压过高，需要及时更换 安捷伦液相色谱仪更换过滤白头安捷伦液相色谱仪更换过滤白头 •密封圈老化、磨碎，导致漏液密封圈老化、磨碎，导致漏液 •检测器的维护一检测器的维护一氘灯（寿命氘灯（寿命2000h左右，价格左右，价格5000-6000元）元）①①不宜频繁开关不宜频繁开关 开开+关关=4小时小时②②需要用时才开，不使用时最好关闭需要用时才开，不使用时最好关闭③③冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器冲柱（平衡或冲洗）时可以不接检测器 一是节省灯的使用，二是防止污染检测器一是节省灯的使用，二是防止污染检测器 多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打多数仪器的检测器电源开关在开机时就已打开，但灯的开关并没有开。
开，但灯的开关并没有开 •检测器的维护二检测器的维护二①①不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等不用时充满有机流动相，如甲醇，乙腈等②②长时间未用在开始使用时检测器内可能会长时间未用在开始使用时检测器内可能会有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大有气泡，现象是检测信号呈锯齿状剧烈大幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检幅度波动，解决方法是快速堵住和放开检测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间测器的出液口，堵住时使其内部压力瞬间增大放开后气泡会被冲出增大放开后气泡会被冲出③③检测器（连有进出液两管）被堵，先检查检测器（连有进出液两管）被堵，先检查是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），是否是进液管被堵（多数情况下它被堵），用小流速倒冲，出液管连接泵用小流速倒冲，出液管连接泵 •色谱柱的维护色谱柱的维护①①色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一色谱柱的保存参考购买色谱柱的说明书，一般反相色谱柱（般反相色谱柱（C18，，C8等）用色谱纯甲醇等）用色谱纯甲醇或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存或乙腈充满后用堵头密封两头冰箱内保存②②色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用色谱柱在开始使用时（或使用完毕时），用洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时洗脱能力强的流动相冲洗，除去上次使用时（或本次使用时）残留在固定相上的样品污（或本次使用时）残留在固定相上的样品污染物等。
染物等③③色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污色谱柱冲洗过程中最好不接检测器，防止污染了检测器染了检测器④④色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等）色谱柱使用多次后（出现柱压高、柱效低等）参考说明书冲洗再生参考说明书冲洗再生 ⑤⑤色谱柱的正确连接色谱柱的正确连接 尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽尽量减小缝隙，以减小死体积，减小色谱峰的展宽 常见商品反相色谱键合固定相常见商品反相色谱键合固定相键合相稳定性取决于键合技术键合相稳定性取决于键合技术 流动相中有机组分流动相中有机组分含量高时含量高时流动相中有机组分流动相中有机组分含量低时含量低时 传统的键合和封端（封尾）传统的键合和封端（封尾）固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷封端封端三甲基氯硅烷三甲基氯硅烷 流动相流动相流动相流动相pHpH低于低于低于低于2 2的环境中的环境中的环境中的环境中传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，传统的键合相分子容易水解而流失，造成色谱柱损伤，具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应具体表现为保留减弱和残余硅羟基效应 侧链位阻基团大的侧链位阻基团大的键合相分子键合相分子可以提高酸性条件可以提高酸性条件下的稳定性下的稳定性 无封端无封端 双封端双封端 三封端三封端 双齿双齿双封端双封端 如何查阅色谱柱说明书如何查阅色谱柱说明书主要依据色谱柱及填料参数主要依据色谱柱及填料参数 色谱柱参数色谱柱参数•基质类型基质类型•粒径大小粒径大小•孔径大小孔径大小•碳含量高低碳含量高低•封尾类型封尾类型•色谱柱内径色谱柱内径•色谱柱长度色谱柱长度 超高效液相色谱（超高效液相色谱（UPLC））UPLC和快速液相色谱和快速液相色谱 •仪器方面代表性的是仪器方面代表性的是2004年年Waters公司推出公司推出Aquity 超高效液相色谱超高效液相色谱(UPLC)，，Agilent公司公司 从从2006年相继推出年相继推出Agilent 1200、、1260、、1290具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液具有更高耐压限和灵活性的高分离度快速液相色谱系统（相色谱系统（RRLC）。
•色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同色谱柱方面在市场上出现了不同规格、不同品牌的亚品牌的亚2μm（（1.7μm）的色谱柱，及性能和）的色谱柱，及性能和工作范围各不相同的超高效液相色谱产品工作范围各不相同的超高效液相色谱产品 使用亚使用亚2微米粒径的色谱柱，用微米粒径的色谱柱，用Agilent 1200系列高分离度快系列高分离度快速液相色谱（速液相色谱（RRLC）系统进行快速和超快速分析）系统进行快速和超快速分析 UPLC•超超 高高 效效 液液 相相 色色 谱谱 （（ Ultra Performance Liquid Chromatography\ UPLC））是是分分离离科科学学中中的的一一个个全全新新类类别别，，UPLC借借助助于于HPLC（（高高效效液液相相色色法法））的的理理论论及及原原理理，，涵涵盖盖了了小小颗颗粒粒填填料料、、非非常常低低系系统统体体积积及及快快速速检检测测手手段段等等全全新新技技术术，，增增加加了了分分析析的的通通量量、、灵灵敏敏度度及及色色谱谱峰峰容容量量超超高高效效液液相相色色谱谱是是一一个个新新兴兴的的领领域域，，作作为为世世界界第第一一个个商商品品化化UPLC产产品品的的Waters ACQUITY UPLCTM 超超高高效效液液相相色色谱谱系系统统在在1996年年问问世世，，之之后后像像安安捷捷伦伦、、岛岛津津等等公公司司也也陆陆续续开开始始生生产产超超高高效效色色谱谱仪仪。
目目前前，，超超高高效效液液相相色色谱谱仪仪已已经经开开始始逐逐渐渐地地投投入入液液相相实验中 Agilent 1290 液相色液相色谱系系统 •UPLC的原理与的原理与HPLC相同，所改相同，所改变的地方主要的地方主要有以下几点：有以下几点：①①小小颗粒、高性能微粒固定相的出粒、高性能微粒固定相的出现HPLC色色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是粒径是5um，而，而UPLC的色谱柱，会达到的色谱柱，会达到3.5um，甚至，甚至1.7um，具有更高柱效，更加利于物质，具有更高柱效，更加利于物质分离②②超高超高压输液液泵的使用由于使用的色谱柱粒径由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵 ③③高速采样速度的灵敏检测器高速采样速度的灵敏检测器④④与传统的与传统的HPLC相比，相比，UPLC的速度、灵敏度的速度、灵敏度及分离度分别是及分离度分别是HPLC的的9倍、倍、3倍及倍及1.7倍，倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。
降低了分析成本UPLCUPLC比比HPLCHPLC更更为为优优越越，，主主要要表表现现为为更更高高效效的的分离效率，即分析时间更短和分离度更大分离效率，即分析时间更短和分离度更大 制备色谱制备色谱 •制制备备色色谱谱是是能能够够获获得得一一定定量量（（从从几几毫毫克克到到千千克甚至吨级）纯品的色谱分离方法克甚至吨级）纯品的色谱分离方法•制制备备色色谱谱在在医医药药工工业业（（如如外外消消旋旋体体药药物物分分子子的的分分离离）），，生生化化技技术术（（生生物物制制品品的的纯纯化化和和植植物物化化学学组组分分的的纯纯化化）），，精精细细化化学学品品的的生生产产方方面面已已成成为为越越来来越越重重要要的的制制备备分分离离手手段段很很多多高纯标样只能用制备色谱获得高纯标样只能用制备色谱获得•为为了了满满足足生生物物、、中中药药等等复复杂杂体体系系分分离离纯纯化化的的任务，任务，制备色谱越发发挥出其作用制备色谱越发发挥出其作用 •制制备备型型液液相相色色谱谱技技术术可可以以简简单单的的认认为为是是分分析析型型液液相相色色谱谱技技术术的的放放大大，，一一是是输输液液泵泵有有高高的的流流量量，，二二是是所所用用的的色色谱谱柱柱有有大大的的直直径径和和柱柱填填料料有有大大的的粒粒径径，，三三是是大大的的进进样样量量，，四是可以获得纯品。
四是可以获得纯品•分分析析型型色色谱谱注注重重的的是是分分离离度度和和分分离离速速度度，，而而制制备备色色谱谱以以获获得得纯纯品品为为唯唯一一目目的的，，在在牺牺牲分离度和分析速度的前提下获得纯品牲分离度和分析速度的前提下获得纯品 制备型与分析型液相色谱的异同制备型与分析型液相色谱的异同•分析色分析色谱目的分析目的分析样品，制品，制备色色谱以以获得得纯品品为目的目的•分分析析型型色色谱进样量量小小够检即即可可，，制制备色色谱进样量量尽尽可可能大•分析色分析色谱柱内径柱内径1-5mm，制，制备色色谱柱柱1-10cm甚至更大甚至更大•分析柱填料分析柱填料<5μm，制，制备柱填料柱填料>7μm•分析色分析色谱流速流速<5mL/min，制，制备色色谱流速流速> 10mL/min•分分析析色色谱检测器器可可以以破破坏坏样品品（（如如电化化学学检测器器）），，制制备色色谱检测器不能器不能对样品造成破坏品造成破坏•分分析析色色谱流流动相相不不需需要要易易挥发，，制制备色色谱流流动相相必必须具有具有挥发性，才利于蒸干性，才利于蒸干获得得样品品组分的分的纯品表表表表14-214-2 •制制备备色色谱谱根根据据制制备备量量的的高高低低分分为为半半制制备备、、制制备备和和工工业业制制备备三三大大类类，，所所用用色色谱谱柱柱规规格格也也是是越越来来越越大大，，制制备备色色谱谱柱柱价价格格昂昂贵贵，，从从几几千千到到几几万万甚甚至几十万。
至几十万•经经典典的的制制备备色色谱谱多多用用大大粒粒径径的的硅硅胶胶填填装装玻玻璃璃柱柱作作为为制制备备色色谱谱柱柱，，用用正正己己烷烷-二二氯氯甲甲烷烷等等正正相相色色谱谱流流动动相相作作为为淋淋洗洗液液制制备备分分离离纯纯化化样样品品组组分分，，方法成本较低，但是效率低方法成本较低，但是效率低•自自动动化化的的制制备备色色谱谱仪仪连连接接高高分分离离能能力力的的制制备备色色谱柱，能够进行快速高效的自动化制备谱柱，能够进行快速高效的自动化制备 制备色谱分离方法的建立制备色谱分离方法的建立•建建立立制制备备型型液液相相色色谱谱的的方方法法时时要要从从分分析析型型液液相相色色谱谱的的方方法法开开始始，，一一般般制制备备色色谱谱柱柱相相应应配配备备一一根根分分析析色色谱谱柱柱，，在在分分析析色色谱谱柱柱上上先先进进行行色色谱谱分分离离条条件件的的实实验验，，调调节节色色谱谱条条件件（（主主要要是是流流动动相相组组成成、、流流速速））获获得得满满意意的的分分离离度度，，分分离离度度越越大大越越利利于于制制备备分分离离，，再再以以该该条条件件为为基基础础，，在在制制备备色色谱谱柱柱上上进进行行实实验验，，最最终终确确定定制制备备色色谱谱条条件件，，进进行行大大量量的的制制备备纯纯化化。
可可以以先先初初步步制制备备分分离离，，再再进进行行二二次次制制备备分分离离，，以以获得纯品获得纯品 国内色谱产业的发展任重而道远国内色谱产业的发展任重而道远 。