地中海贫血基因检测PCR扩增扩增DNA 实验目的实验目的•1、掌握掌握PCR的原理的原理•2、熟悉熟悉PCR操作过程操作过程•3、了解了解PCR的临床应用的临床应用 实验原理•PCR（（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反）：聚合酶链式反应，应，•PCR过程类似于DNA的天然复制过程，包括DNA双链解开，引物配对，合成三步；•在在DNA聚合酶催化下，以母链聚合酶催化下，以母链DNA为为模板模板，以特定，以特定引物引物为延伸起点，通过为延伸起点，通过变性、退火、延伸变性、退火、延伸等步骤，体外等步骤，体外复制复制出与母链模板出与母链模板DNA互补的子链互补的子链DNA的过程 PCR1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 动画演示动画演示 α-地贫实验原理地贫实验原理（四重（四重Gap-PCR））•根据根据α-地贫地贫3种种缺失范围及断裂点缺失范围及断裂点，分别设计，分别设计特异引物特异引物同时检测，在同时检测，在3种缺失片段的共同区种缺失片段的共同区域还设计一对域还设计一对正常内对照正常内对照引物，当发生任一引物，当发生任一种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩增增;根据阳性根据阳性扩增片段组合扩增片段组合结果诊断各种不同结果诊断各种不同基因型基因型。
α-地贫基因缺失示意图 a a3.7 a a4.2--SEAψα2ψα1 1α2 2α1 1 1 1ζψζ正常内对照正常内对照 β-地贫地贫 PCR实验原理实验原理•设计特异的设计特异的PCR引物且其引物且其5‘端用端用生物素生物素进行进行标记，扩增获得一定长度的标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段，该片段包含了所要检测的各个位点片段包含了所要检测的各个位点 What’s in the PCR TubeTarget DNATarget DNA5’3’3’5’primersprimersABFreeFreenucleotidesnucleotidesTaq Taq DNADNApolymerasepolymeraseMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+BufferBuffercontainingcontainingmagnesiummagnesium PCR原理原理:实质就是实质就是体外基因体外基因复制复制技术技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶聚合酶 AmpErasePrimer靶序列靶序列.加热变性加热变性95 °C靶序列引物退火靶序列引物退火55 °C引物延伸引物延伸72 °C • PCR扩增 （α-地中海贫血）PCR-Mix-I （蓝色管） 21μLDNA模板 4μLTotal 25μL• 96℃℃ 5 min•98℃℃ 45sec 65℃℃ 90sec 72℃℃ 3 min •98℃℃ 30sec 65℃℃ 45sec 72℃℃ 3 min •72℃℃ 10 min （（25cycles））（（10cycles）） 操作步骤操作步骤 PCR扩增 （β-地中海贫血地中海贫血））•用生物素标记的引物扩增待测样品DNAPCR-Mix-I（紫色管）23μLDNA模板 2μLTotal 25μL50℃15min95℃ 10min94℃ 1 min50℃ 30s 35 cycles 72℃ 30s72℃ 5min 试剂试剂盒组成：•（1）PCR反应液 （已包含PCR扩增所需的缓冲液、引物、 dNTPs、 DNA聚合酶等）•（2）纯水 仪器设备•离心机 •加样枪•PCR扩增仪（使用介绍）•1、、PCR扩增循环条件的设置扩增循环条件的设置(PCR仪请使用热盖仪请使用热盖)：：若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。
•2、 扩增结束后，不立刻电泳请取出放冰箱保存扩增结束后，不立刻电泳请取出放冰箱保存 操作步骤操作步骤•1 取出冻存的DNA解冻•2 试剂准备 取所需的反应管PCR Mix-A,若管盖上有液体附着的 请低速离心数秒•3、加样 在反应管上做好标记，分别加2-4ul已提取的待测样品、阴性质控、阳性质控，终反应体积为25ul，低速离心数秒转移至扩增区 质量控制•1 阴性质控（ 灭菌双蒸水 ）•2 阳性质控（缺失型/突变型） 随病人标本检测,不同缺失/突变类型可以依次轮流循环作为质控检测 PCR PCR 常见问题之一常见问题之一q 假阳性假阳性 现象：现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物M + - 1 2 PCR PCR 常见问题之二常见问题之二q 无扩增产物无扩增产物 现象：现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；；M样品样品样品样品正对照正对照 注意事项•1、在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染•2、PCR反应的加样量多数是微量的，所以加样时应把枪头伸进液面下加样，并注意确保试剂确实加进去了！•3、加样过程中注意防止污染样品及试剂。
•4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应 思考•1、试述PCR技术的基本原理 •2 、、问：在问：在Gap-PCR中为什么α正常DNA序列不能生成相应的扩增产物而缺失序列可以扩增出特定长度的片段。