革兰氏染色法目的要求•学习并掌握革兰氏染色的方法实验材料•菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌 •染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘 液、95%乙醇、番红液（沙皇复染液） •其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等基本原理•革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一 种鉴别染色法•1884年由丹麦医师Gram创立实验内容•对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌分别进行革兰氏染色•对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进行革兰氏染色•经碱性染料结晶紫染色•经碘液媒染•用酒精脱色ü 有的细菌紫色不被脱去——（G+），ü 有的可被脱去——（G-）步骤• 脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等 进行复染• 阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色• 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有 的放线菌和真菌都成革兰氏正反应（G+）• 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆 菌都成负反应（G-）•革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组 成和生理性质上有很多差别，染色反应 不一样•革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质 镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫 的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌 复合物结合程度低，吸附染料差，易脱 色，这是染色反应的主要依据。
•与细菌细胞壁的化学组成及结构有关•革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量 高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水 ，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶 紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱 色n革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量 高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了 脂类物质，使细胞壁通透性增加， 结晶紫——碘复合物易被抽出，于 是被脱色•阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同 pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料 较多，因此不易脱去，阴性菌则相反所 以染色时的条件要严格控制方法与步骤•涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色 （1min）→水洗→路哥氏碘液媒染（ 1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s）→ 水洗→番红复染（1min）→水洗→干燥 →镜检制 片n取一片载玻片，在中央滴一小滴生理盐 水，用接种环以无菌操作，从单个菌落 中挑取少量的菌于生理盐水滴中，混匀 并涂成薄膜干 燥n涂面朝上，瞬间通过火焰2-3次，使生理 盐水完全干初 染n在菌膜上滴加结晶紫染色1分钟，用蒸馏 水进行冲洗（不要正对着菌膜冲，以免 将细菌冲掉），至无紫色液体流出固 定n用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜1分 钟，对结晶紫染色进行巩固，之后用蒸 馏水对其进行冲洗，至无颜色流出为止 。
脱 色n将玻片倾斜，用滴管吸95%的酒精进行 冲洗脱色30秒，立即用蒸馏水冲洗复 染n用沙皇复染液对其进行复染1分钟，用蒸 馏水冲洗镜 检n用滤纸将水吸干，滴1滴香柏油在菌膜中 央，用油镜观察•严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度， 则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时 ，阴性菌被误染为阳性菌•菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时 间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都 常呈阴性反应 关键点大肠杆菌（G-）枯草芽孢杆菌（G+）金黄色葡萄球菌与大肠杆菌实验思考题•大肠杆菌和枯草芽孢杆菌染色后，是G-还是 G+？ •为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄有所要求 ？ •你的实验结果与与培训中所述是否一致？如 果不一致，试分析原因。