1虾类和蟹类的过敏原组分分析作者：毛露甜, 范红英, 张在军, 黄婉慧, 杨华胜, 周立斌【摘要】 目的: 分析虾类和蟹类的过敏原组分方法: 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）和 Western blot 分析虾类和蟹类的主要过敏原组分结果: 不同种类的虾其主要过敏原组分相对分子质量(Mr)在 36 000 附近, 不同种类的蟹主要过敏原组分 Mr 在 29 000、 36 000、 66 000、 89 000 附近结论: 不同种类的虾蟹存在共同过敏原 【关键词】 虾 蟹 过敏原 免疫印迹过敏症是一类常见变态反应性疾病, 近年来其发病率明显上升食物过敏原已成为食品安全隐患之一［1］, 食物过敏是急需研究的新课题［2］我国对食物过敏的研究和关注与国外发达国家相比有较大差距, 但随着经济的发展和人民生活水平的提高, 人们对过敏症的关注和重视大为提高虾蟹等水产品是常见的过敏性食物［3］, 在我国尤其沿海地区常见食用虾蟹引起过敏的报道［4］有资料显示, 河虾的过敏率高达 39.0%, 远高于其他种类的食物过敏［5］近年来, 美国食品药品管理局（FDA）和欧洲食品安全局（EFSA）都针对食品中的过敏原成分制定了相应的法规［6, 7］。
本研究中, 我们分析了虾类和蟹类的过敏原组分, 对保障人们食品安全、提高生活质量有着积极的意义1 材料和方法1.1 材料 HRP 标记羊抗人 IgG 购自鼎国生物公司; HRP 标记羊抗人 IgE 购自Serotech 公司; 牛血清白蛋白购自 Sigma 公司; 蛋白质相对分子质量(Mr)标准购2自 TaKaRa 公司; PVDF 膜购自美国 Osmonics 公司; 96 孔酶标板购自 Biomat 公司; MINI PROTEAN11TM 垂直板电泳仪和转移系统购自 BIO RAD 公司; 全自动酶标仪购自 Thermo 公司, TGL 16G 冷冻离心机、 S53 型紫外可见光分光光度计、 DY B2 型脱色摇床均为上海三科公司的产品虾类（刀额新对虾、 日本沼虾、 口虾蛄）和蟹类（中华绒螯蟹、 梭子蟹、 青蟹）购自惠州市西湖市场, 均为活品从惠州市中心人民医院检验科收集 20 例虾、 蟹过敏患者的阳性血清, 等量混合组成标准血清, 采无过敏症的健康人血清作阴性血清分离血清并分装后于-20℃冻存备用1.2 方法1.2.1 虾、 蟹过敏原浸液的制备及 SDS PAGE 分析 参照文献［8］的方法略作修改, 取其肉用组织搅拌机捣碎后用预冷的丙酮去脂 3 次至脱脂完全为止, 待丙酮完全挥发后, 以 0.01 mol/L PBS 为提取液按 1∶20 加入虾/蟹的丙酮粉, 置 4℃冰箱冷浸过夜以提取过敏原蛋白。
以 12 000 r/min 转速冷冻离心 20 min, 用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后, 过滤除菌, 分装, -20℃保存备用将待分析的过敏原与上样缓冲液等体积混合, 煮沸 3～5 min 使蛋白变性, 取适量样品上样, 以溴酚蓝指示, 考马斯亮蓝 R 250 染色后脱色至背景为无色为止1.2.2 Western blot 分析虾、 蟹的过敏原组分 参照文献［9］的方法, 各种虾蟹的蛋白经 SDS PAGE 分离后, 湿印迹至 PVDF 膜, 30 g/L BSA 4℃封闭过夜, 与相应过敏症患者的阳性血清（1∶20）反应, 用无过敏症的健康人血清设阴性对照4℃孵育过夜, 洗涤后加入羊抗人 IgE HRP（1∶300）二抗, 37℃孵育 2 h, 用底物DAB 显色, 显色条带与预染的 Mr 标准对照, 确定其 Mr32 结果2.1 SDS PAGE 分析虾类的蛋白组分 刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄的蛋白浸液经 SDS PAGE 分析见图 1,结果显示, 刀额新对虾可辩条带 14 条, 组分Mr 分布在 15 000～97 000 之间, 其中主条带有 7 条, Mr 分别为 21 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66800 和 74 700。
日本沼虾可辩条带 11 条, Mr 分布在14 000～97 000 之间, 其中主条带有 9 条, Mr 分别为 21 000、 25 000、 29 000、 32 000、 36 000、 44 000、 52 000、 66 800、 74 700口虾蛄可辩条带 12 条, Mr分布在 14 000～97 000 之间, 其中主条带有 9 条, Mr 分别为 15 000、 20 000、 23 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66 800、 89 000图 1 不同虾类蛋白浸液的 SDS PAGE 分析（略）1: 蛋白 marker; 2: 刀额新对虾; 3: 日本沼虾; 4: 口虾蛄.2.2 SDS PAGE 分析蟹类的蛋白组分 中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹的蛋白浸液经 SDS PAGE 分析, 结果如图 2 所示, 中华绒螯蟹可辩条带 11 条, 条带 Mr分布在 20 000～90 000 之间, 其中主条带有 7 条, Mr 分别为 20 100、 29 000、 33 000、 35 000、 38 000、 49 000、 66 400。
青蟹可辩条带 13 条, 条带 Mr 分布在14 000～90 000 之间, 其中主条带有 9 条, Mr 分别为 14 300、 20 100、 27 000、 29 000、 35 000、 38 000、 44 300、 66 800、 89 000梭子蟹可辩条带 17 条, 条带 Mr 分布在 15 000～90 000 之间, 其中主条带有 10 条, Mr 分别为 15 000、 19 900、 22 000、 27 000、 29 000、 38 000、 44 300、 49 000、 66 800、 89 000 图 2 不同蟹类蛋白浸液的 SDS PAGE 分析（略）41: 蛋白 marker; 2: 中华绒螯蟹; 3: 青蟹; 4: 梭子蟹.2.3 Western blot 分析虾类的过敏原 3 种虾的粗提液经 Western blot 分析, 结果见图 3刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄 3 种浸液中的 36 000 的蛋白组分均可与虾过敏患者的血清 IgG 和 IgE 结合, 说明 3 种虾的主要过敏原均为 36 000 的蛋白组分3 种虾的印迹膜与阴性血清反应均未显条带。
2.4 Western blot 分析蟹类的过敏原 3 种蟹的粗提液经 Western blot 分析, 结果见图 4中华绒螯蟹的印迹膜可与蟹过敏患者的阳性血清 IgG 和 IgE 结合, 主要过敏原 Mr 为 66 000 的组分; 青蟹蛋白组分中可促使机体产生 IgG 的蛋白质Mr 分别为 36 000、 89 000, 而促使 IgE 产生的蛋白质 Mr 分别为 27 000、 36 000、 89 000; 梭子蟹印迹膜与蟹过敏阳性血清 IgE 结合的蛋白质 Mr 分别为 36 000 和 89 000 的组分, 而与 IgG 结合的蛋白质 Mr 分别为 29 000 和 89 0003 种蟹的印迹膜与阴性血清反应均未见条带图 3 Western blot 分析虾类的过敏原组分（略）M: 蛋白 marker; 1-3: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄的 SDS PAGE图谱; 1a-3a: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄与 IgE 结合的条带; 1b-3b: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄与 IgG 结合的条带; 4, 5: 阴性对照试验.图 4 Western blot 分析蟹类的过敏原组分（略）M: 蛋白 marker; 1-3: 分别为中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹的 SDS PAGE 图谱; 1a-3a: 分别为中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹与 IgE 结合的条带; 1b-3b: 分别为中华5绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹与 IgG 结合的条带; 4, 5: 阴性对照试验.3 讨论虾的蛋白质组成均存在一定差异, 在 Mr 为 36 000 附近, 本研究中的这 3 种虾均出现了明显条带, 这与李振兴等［10］报道的结果基本一致, 部分结果有差异可能是虾蟹和人的种属差异引起的。
Mr 36 000 的组分也是国外报道的最可能引起过敏的虾类过敏原——原肌球蛋白, 超过 84％的虾过敏症患者血清能与其发生作用本研究结果显示, 即使属于不同的目（十足目和口足目）, 虾的主要过敏原没有明显变化, 这与原肌球蛋白在肌原纤维中最稳定的特性相吻合本实验中分析的 3 种蟹都为十足目但属于不同科, 其过敏原 Mr 分布在 29 000～89 000 之间, 主要过敏原 Mr 为 36 000 和 89 000 的蛋白组分可见虾与蟹作为甲壳类水产品具有共同的过敏原, 这与 Martinez 等［11］报道的原肌球蛋白是无脊椎动物的主要过敏原并且相互之间存在严重交叉反应的结论相吻合参考文献】［1］ Dearman RJ, Kimber I. Food allergy: what are the issues?［J］. Toxicol Lett, 2001,120 (1-3): 165-170.［2］ Malarkey T. Human health concerns with GM crops［J］. Mutat Research, 2003, 544(2-3): 217-221.［3］ Schafer T, Bohler E, Ruhdorfer S, et al. Epidemiology of food allergy/food intolerance in adults: associations with other manifestations of atopy［J］. Allergy, 2001, 56(12): 1172-1179.［4］ 伍秋容. 广州地区不同年龄组过敏性疾病患者的致敏原分布特性分析［J］. 华南预防医学, 2005, 31(2): 60-62.［5］ Liang GZ, Li FJ, Hou SB, et al. Analysis of allergens of allergosis in 1625 6cases［J］. Pract Clin Med, 2005, 6(7): 14-16.［6］ Rene C. Allergens: the European approach［J］. J Food Sci, 2004, 69(4): 343- 346.［7］ Vierk K, Falci K, Wolyniak C, et al. Recalls of foods containing undeclared allergens reported to the US food and drug administration, fiscal year 1999［J］. J Allergey Clin Immunol, 2002, 109(6): 1022-1026.［8］ 赵绮华, 王锡忠, 陈丽金, 等. 梭子蟹变应原的分离、 纯化与鉴定［J］. 中国免疫学杂志, 2007, 23(3): 256-259.［9］ 张红云, 宋娟娟, 刘志刚, 等. 荔枝果实中 profilin 的表达纯化及其与桦树花粉 Bet v 2 的交叉反应性研究［J］. 免疫学杂志, 2007, 23(5): 541-544.［10］ 李振兴, 林 洪, 李明华, 等. 不同虾类的过敏原及其过敏原性［J］. 水产学报, 2006, 30(2): 281-284.［11］ Martinez A, Martinez J, Palacios R, et al. Important of tropomyosin in the all。