基因组学课件物理图绘制

第3章 物理图绘制Physical map wA chromosome map of a species that shows the specific physical locations of its genes and/or markers on each chromosome. Physical maps are particularly important when searching for disease genes by positional cloning strategies and for DNA sequencing. 为何要绘制物理图？遗传分析绘制的基因组图 为何不能指导基因组计划的测序？主要原因有 二点： 遗传图的分辨率有限 遗传图的精确性较低 图3.1 酵母3号染色 体遗传图与 物理图比较限制性内切酶发现第一个物理图：SV40（Danna & Nathans,1971 ）新克隆技术：YAC & BAC片段长度长，STS（Olson,1989）→物理图谱图 标第一个基因组测序Phi X174，1977，英国Sanger实验室人类物理图谱标记：全基因组物理图谱法国Daniel Cohen领导的CRPH美国Eric Lander领导的Whitehead基因组研究中心分辨率低：0.5~1Mb各染色体物理图谱最早完成的是Y和21号分辨率高，100Kb两个重要参数有顺序路标（Ordered Markers）的平均距离总路标的平均距离7号染色体美国NIH的Eric Green小组STS间平均距离79kb真正分离率平均88Kb：90%有明确顺序Eric Lander领导的MIT小组图谱分辨率：170Kb有顺序路标的平均距离：1Mb路标(Landmark)：标位工具STS和限制性内切酶位点单位(Unit)顺序(Order)一维空间，路标间的相对位置可复制的片段（Clonable Fragments）辐射杂交株，YAC，BAC，P1，Cosmid， Fosmid以及其它细菌复制系统常用的物理作图方法： 限制性作图（Restriction mapping） 依靠克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) 荧光标记原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作图 顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图 3.1 限制性作图 3.1.1 限 制 性 作 图 的 基 本 原 理 3.1.2 DNA分子限制性作图 获得理想大小的DNA片段对基因组的 限制性作图至关重要，其关键是选择合 适的限制酶 识别位点硷基数目 预计DNA片段平均长度（kb ） 4 1 6 4 8 64 10 1000 限制性作图的局限限制位点多时，产生大量的片段，难以 排序 无法区分大小相同的片段稀有切点限制酶系指该酶识别的碱基顺序在基 因组中只有很少数量，可产生较大的DNA片 段 选用稀有切点限制酶时有几点必须注意：识别顺序越长产生的片段越大。

但当识别位点中 含有非特异顺序时，由于随机选择的干扰，片段 的长度比预期的小识别位点的碱基组成影响限制性片段的大小有些限制酶识别位点较长（Sc: I-Sce，18bp）基因组DNA的甲基化状态Ø5’CG3’ → 5’TG3’ ØSma I（ 5’CCCGGG3’ ） →78kbØBssH II（ 5’GCGCGC3’ ） →390kbØNot I（ 5’GCGCGCGC3’ ） →1Mb大肠杆菌基因组NotI限制性物理图 （引自Smith 等，1987） 大分子DNA片段的分离 脉冲凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) 基本原理:将一个方向不断变换的电场 取代简单的单一电场（单向电场），使 电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭 转迁移方向，达到分离的目的 常规 或非 常规 琼脂 糖凝 胶电 泳 Gmcyc3a & Gmcyc3bVector50Kb100Kb150Kb200Kb250Kb300Kb限制性片段的光学作图 光学作图（optical mapping）（ Schwartz, 1993），可用于限制性片段的 物理图绘制 制备光学作图DNA的方法：凝胶伸展术 （gel stretching）和分子梳理术（ molecular combing） 染色体DNA 凝胶伸展术 3.2 基于克隆的基因组作图 克隆大于100 kb DNA的突破首先是从酵母人 工染色体（yeast artificial chromosomes, YAC）的发明开始的（Burke等，1987） YAC载体主要由3个基本部件构成： 着丝粒 在细胞分裂时负责染色体均等分配。

端粒 位于染色体端部的特异DNA序列，保持人工 染色体的稳定性 自主复制起始点（autonomous replication sequences, ARS） 在细胞中启动染色体的复制 酵母人工染色 体（YAC）操 作 （A）酵母人工 染色体载体 pYAC 3物理图 B）外源 DNA的克隆过 程 噬菌体P1载体（Sternberg, 1990）克隆的片 段可达125 kb  细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosomes, BAC）（Shizuya等，1992） P1人工染色体（P1-derived artificial chromosomes）又称PAC（Ioannous等， 1994）F粘粒（Fosmids）:该载体含有F质粒的复制 起始点以及λ的COS位点可载片段达300 kbpBAC为mini-F的衍生质粒OriS和repE基因介导F因子的单向 复制，parA和parB维持低水平质粒 拷贝数，每个基因组约1-2个拷贝CosN为λ噬菌体末端酶专一性切割 位点，loxP为P1 Cre蛋白作用位点 ，均可将环状BAC DNA转变为线 型分子，便于物理图绘制HindIII和BamHI为外源DNA插入位 置，两侧的NotI位点可用于直接检 测克隆的大分子DNALoxP位点将该载体分为两 个结构区一个结构区含有P1 pac顺 序，pBR322复制起始点和 一段约10 kb来自腺病毒的 填充区段另一结构区含有P1质粒复 制子，卡那霉素抗性筛选标 记基因（KanR），IPTG诱 导裂解复制子和正筛选 sacBII卡盒Sac基因：果聚糖（死亡） →蔗糖（>2%，不能生长 ）3.1.2 重叠群组建 相互重叠的DNA片段组成的物理图称为重 叠群（contig） 克隆重叠群的组建： 染色体步移（chromosomal walking）法 染色体步移 以PCR方法进行染色体步移 点阵组合筛选法（组合PCR） 基因产物 大小ForwardReverse退火 温度 Gmcyc1 a1021bp5’- GCTCCAATAATCCCAGAAAC- 3’5’-AAACACAGAAAGATGCCTCC -3’56℃Gmcyc1 b1301bp5’- TGCAAAATCTGCATATGTAAACAT G-3’5’- TTCTTGGCTGATATAGAGCAACAAC- 3’ 53℃Gmcyc2 a1322bp5’- CATCTTCTTCTTCATACCCTC C-3’5’-GATTCCTTGGCAAACCACTA -3’56℃Gmcyc2 b1300bp5’- TGAGTCAATCTTCAAATGTTT CC-3’5’- CCAATCTAGTGCAAATTAACGT G-3’53℃Gmcyc3 a1362bp5’- GAGGACTGTACTTGGACCGTTAA G-3’5’- GATCAGATATTACCGAAAACTAGC- 3’56℃Gmcyc3 b398bp5’- GTTAGTCGGGGTGACATTAA G-3’5’- CATTTCTTGGTGCTTCATTATC- 3’56℃M Gmcyc1aGmcy c1bGmcyc2aGmcy c2bMMGmcyc3aGmcyc3b•240板← 96120/384 •每板混合为一个Z元素 •Z 轴包括240个样品， 放在一块384板上Z AXIS筛选•12块板为一组 •X & Y各有20组←240 /12•12块板的所有相同行 样品放在一起，构成Y 轴元素 • 每组Y轴含16个样品 •表示方式: A→P•12块板的所有相同列样品放 在一起，构成X轴元素 • 每组X轴含24个样品 •表示方式: 1→24Gmcyc2 bGmcyc1bGmcyc1aGmcyc1aControlPositiveControlPositiveControlGenome DNA = Unique Control StandardPositive = Mixture from 384 samplesGmcyc1aGmcyc2aGmcyc2b1X & 1Y=1 clone2X & 2Y ≦ 8 clone3X & 3Y ≦ 27 cloneGmcyc3aGeneNumberBAC Clones Gmcyc1a544-D19,59-I12,102-L10,119-J18,165-C4,86-P6 Gmcyc1b3127-N13,206-A3,98-G17 Gmcyc2a879-k20,149-E7,73-E7,96-L24,146-N14,148-B12, 181- N11,189-M15,197-E5 Gmcyc2b313-G15,75-F5,203-O3 Gmcyc3a3111-E7,153-J11,26-E13 Gmcyc3b3144-N10,148-G10,149-E213.2.3 指纹作图 限制性带型（Restriction patterns）指纹 重复顺序DNA指纹（Repetitive DNA fingerprints） 重复顺序DNA PCR （Repetitive DNA PCR ）或分散重复顺序PCR（interspersed repeat element PCR, IRE-PCR）指纹 STS容积积作图（STS content mapping） 四种指纹分析方法 制备克隆DNA克隆的DNA指纹分析：酶切，电泳分离，杂 交标记或图像处理克隆的排列和DNA片段得排序填空隙：分离新克隆，PCR验证三个代表性的方法：大肠杆菌酵母线虫大肠杆菌4.6 Mb，Kohara，1987，日本策略：不完全酶切，放射性标记杂交特点：标记载体作为探针来识别不同的DNA片段缺点：技术难，不能规模化酵母12 Mb，Olson，1986， Maynard Olson实验室策略：随机取样，限制性内切酶完全酶切指纹法特点：噬菌体，用克隆间重叠排出克隆和酶切片段顺序缺点：需要自行设计软件线虫50 Mb，Coulson, 1986策略：完全酶切，末端标记特点：Cosmid缺点：多拷贝，克隆的稳定性差多酶完全切法（Multiple-complete-digest,MCD）Wong, 1997琼脂电泳，图像分析和图谱组装自动化步骤：组建Cosmid文库；随机取样，制作DNA指纹， 10~15×覆盖率；识别整体片段；图谱组装BamH IEcoR IHind IIIM1-56-78-1516-1819-2122-24Marker Gmcyc1 aGmcyc1 bGmcyc2 aGmcyc2 bGmcyc3 aGmcyc3 bBamH IEcoR IHind IIIM1-56-78-1516-1819-2122-24Marker Gmcyc1 aGmcyc1 bGmcyc2 aGmcyc2 bGmcyc3 aGmcyc3 b899。