中山大学硕士学位论文MBL基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究姓名：陈秋燕申请学位级别：硕士专业：公共卫生指导教师：刘一心20091123中山大学M P H 学位论文M B L 基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究M B L 基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究一研究目的专业名称：公共卫生硕士( M P H )学位申请人：陈秋燕导师：刘一心教授中文摘要通过测定不同组别研究对象的甘露聚糖结合凝集素( M B L ) 的血浆水平及其基因第l 外显子第5 2 、5 4 、5 7 位密码子的碱基序列，了解甘露聚糖结合凝集素基因多态性的分布情况并通过比较不同组别研究对象的甘露聚糖结合凝集素第5 4 位密码子G T C 等位基因频率以及血浆水平，探讨甘露聚糖结合凝集素G T C等位基因与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性，及其血浆水平与G T C 等位基因的相关关系从而加深对甘露聚糖结合凝集素免疫功能的了解，以及毛细支气管炎、急性上呼吸道感染、反复呼吸道感染等呼吸道疾病的发病机制的了解，更好地防治婴幼儿呼吸道感染性疾病，促进儿童的心身健康二研究对象、内容与方法( 一) 研究对象1 ．毛细支气管炎组5 0 例2 0 0 5 年至2 0 0 6 年在我院住院治疗的毛细支气管炎患儿，年龄6 个月至2 岁，其中男孩2 7 例，女孩2 3 例，均为汉族，符合诊断标准，无严重合并症，I I I中山大学M P H 学位论文M B L 基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究排除合并反复呼吸道感染者。
2 ．反复呼吸道感染组5 0 例2 0 0 5 年至2 0 0 6 年在本院就诊的反复呼吸道感染患儿，其中男孩2 4 例，女孩2 6 例，年龄6 个月至2 岁，均为汉族，符合诊断标准，无严重合并症，排除曾患毛细支气管炎者，或有哮喘家族史者3 ．急性上呼吸道感染组5 0 例2 0 0 5 年至2 0 0 6 年在本院就诊的急性上呼吸道感染患儿，年龄6 个月至2 岁，其中男孩2 8 例，女孩2 2 例，均为汉族，符合诊断标准，无严重合并症，排除曾患毛细支气管炎者或合并反复呼吸道感染者，或有哮喘家族史者4 ．健康对照组5 0 例2 0 0 5 年至2 0 0 6 年在深圳市妇幼保健院体检的健康婴幼儿，年龄6 个月至2 岁，其中男孩2 5 例，女孩2 5 例，均为汉族，排除曾患毛细支气管炎者、反复呼吸道感染者，或有哮喘家族史者 二) 研究内容、方法1 研究内容( 1 ) 检测以上四组研究对象的甘露聚糖结合凝集素血浆水平及其基因第l 外显子第5 2 、5 4 、5 7 位密码子的碱基序列 2 ) t L 较以上四组研究对象的甘露聚糖结合凝集素第5 4 位密码子G T C 等位基因频率及血浆水平 3 ) 研究甘露聚糖结合凝集素血浆水平与其第5 4 位密码子G T C 等位基因的相关关系。
4 ) 研究甘露聚糖结合凝集素第5 4 位密码子G T C 等位基因与以上三种婴幼儿呼吸道感染疾病的关联强度2 研究方法I V中山大学M P H 学位论文M B L 基冈多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究( 1 ) 应用E L I S A 法定量检测各组研究对象的甘露聚糖结合凝集素的血浆水平( n g ／m 1 ) 2 ) 用聚合酶链反应、D N A 序列测定法分析各组研究对象的甘露聚糖结合凝集素基因第l 外显子第5 2 、5 4 、5 7 位密码子的碱基序列3 统计学处理计量资料( 甘露聚糖结合凝集素的血浆水平) 的描述用均数±标准差( x4 - 曲表示多组样本均数比较采用方差分析，统计分析前先进行方差齐性检验计数资料( 甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基因频率) 的比较用，检验，先计算出各组研究对象的甘露聚糖结合凝集素基因型频率和等位基因频率，然后经H a r d y —W e i n b u r g 遗传平衡定律检验，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有群体代表性，再采用卡方检验进行各组间构成比差异的比较各种疾病与甘露聚糖结合凝集素5 4 位密码子G T C 等位基因的关联强度以比值比( 锹) 代表，O R 值9 5 ％置信区间( c O 的计算采用W O O L F 法。
甘露聚糖结合凝集素的血浆水平与其G T C等位基因的相关性分析用等级资料相关分析所有数据均用S P S S1 3 ．0 统计软件处理，检验标准为P o ．0 5 ；对甘露聚糖结合凝集素血浆水平进行B a r t l e t t 方差齐性检验，，= 2 ．1 7 ，v = 3 ，P > o ．0 5 均可以认为方差齐性，对各组的性别构成比作，检验，对组问年龄均数及甘露聚糖结合凝集素血浆水平均数作方差分析1 1 7 1表3 一l 各组的性别、年龄、M B L 血浆水平，或F 值0 ．8 01 ．9 12 ．9 3P0 ．8 50 ．2 00 ．0 2 *呵’ o ．0 5 ，说明各组间的年龄、性别构成无统计意义差别甘露聚糖结合凝集素血浆水平作方差分析，P 00 5 ，提示毛细支气管炎组、急性上呼吸道感染组、健康对照组之间的甘露聚糖结合凝集素血浆水平无统计意义差别虿3 ．2 甘露聚糖结合凝集素基因第5 4 位密码子P C R 产物测序结果中山大学M P H 学位论义M B L 基冈多忐性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究出cc 盛6GG 器c ^ c 6c c 嚣cG c c 髋G Ⅲc c G “G aG c cG G 强ⅢA c ^ 器^ ^E 盛cc 等L6G2c ^ c G c c c r c G c c6 * 6 ^ ^ G c c G ‰G c cG G 舞^ G c ^ c ^ G 品图3 ·1 甘露聚糖结合凝集素基同D N A 测序结果f 箭头所指折处为第5 4 他密码了碱基序列)3 ．3 甘露聚糖结合凝集素的基因多态性3 ．3 ．1U + 露聚糖结合凝集素第- - # F 显子第5 4 位密码子基因多态性的分布情况毛细支气管炎组患儿甘露聚糖结合凝集索G T C 等位基因频率高于健康对照组婴幼儿( o1 5 v so1 2 ，P > 00 5 ) ，而G C C 等位基因频率低于健康对照组婴幼儿( 08 5V S 08 8 ．P > 0 ．0 5 ) ，两者比较无统计意义差别。
急性上呼吸道感染组患儿甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基因频率高于健康对照组婴幼儿f 01 3 V S 01 2 ，P > 00 5 ) ，而G C C 等位基因频率低于健康对照组婴幼儿( 08 7V S O8 8 ，P > 00 5 ) ，两者比较无统计意义差别反复呼吸道感染患儿甘露聚糖结台凝集素G T C 等位基因频率高于健康对照组婴幼儿( 02 3 V S01 2 ，P 0 ．0 5 ) ，两者比较无统计意义差别表3 —3 各组的甘露聚糖结合凝集素5 4 位密码子基因多态性分布注：‘反复呼吸道感染组与健康对照组的甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基冈频率有统计意义差别，，= 6 ．0 6 ，P 6 0 01 3 51 2 9609 5 ．5 64 ．4 400 ．0 2甘露聚糖结合凝集素血浆水平低于1 0 0 n g ／m l 时，基因型均为突变纯合子G T C ／G T C ，共3 例，G T C 等位基因频率为1 ．O O ；甘露聚糖结合凝集素血浆水平介于1 0 0 ～6 0 0 n g ／m l 之问时，基因型大部分为突变杂合子G C C ／G T C ，共5 l 例( 基因型频率8 2 ．2 6 ％) ，余下1 1 例是野生型纯合子G C C ／G C C ，G T C 等位基因频率为O ．4 1 ；甘露聚糖结合凝集素血浆水平高于6 0 0 n g ／m l 时，基因型大部分为野生型纯合予G C C ／G C C ，共1 2 9 例( 基因型频率9 5 ．5 6 ％) ，仅有6 例显示为突变杂合子G C C ／G T C ，G T C 等位基因频率为0 ．0 2 。
经等级资料【4 1 1 的s p e a r m a n 等级相关分析，r s = ．0 ．7 3 ，产3 0 ．2 6 ，P 0 ．0 5 ，甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基因与毛细支气管炎两者间无关联急性上呼吸道感染组与健康对照组比较，O R = I ．0 9 ，P > 0 ．0 5 ，甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基因与急性上呼吸道感染两者间无关联1 8中山大学M P H 学位论文M B L 基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究第四章讨论4 ．1 甘露聚糖结合凝集素基因多态性的分布情况甘露聚糖结合凝集素[ 3 7 , 3 8 】的蛋白质是多个亚单位的聚合体，每个亚单位由三条完全相同的肽链构成每条肽链包括4 个功能区，即富含半胱氨酸的N 末端区：含2 0 - 2 1 个氨基酸，其中半胱氨酸参与亚单位间N ．端二硫键形成；胶原样区( C L R ) ：含1 8 ～2 0 个氨基酸，为典型的胶原三螺旋结构，参与免疫调理和补体活化过程：颈区：位于胶原区与糖识别区之间，功能尚不清楚，可能与亚单位的稳定有关；C 末端C 型糖识别区( C R D ) ：含1 2 0 氨基酸( 其中有1 7 ～1 8 个保守氨基酸和1 4 个可变氨基酸，保守氨基酸是维持蛋白质特殊的疏水核心所必需) ，呈一花蕾样结构。
花蕾中三花瓣尖平面为一正三角形，此结构为甘露聚糖结合凝集素蛋白质发挥生理效应的基础甘露聚糖结合凝集素的基因【3 9 】位于1 0 号染色体长臂上，含4 个外显子外显子l 编码N 末端区及部分胶原样区( C L R ) ，外显子2 编码其余部分C L R ，外显子3 编码颈区，外显子4 编码C 末端c 型糖识别区( C R D ) 其中第l 外显子的第5 2 、5 4 、5 7 位密码子存在基因多态性，即5 2 ( G G T - - - ' , T G T ) 、5 4 ( G C C - - ' , G T C ) 、5 7 ( G G A _ G A A ) 以第5 4 位密码子为例，它可以为野生纯合子5 4 ( G C C ／G C C ) 、突变杂合子5 4 ( G C C ／G T C ) 、突变纯合子5 4 ( G T C ／G T C ) 三型甘露聚糖结合凝集素的基因多态性与种族有关，南部非洲人以5 7 位密码子突变多见，欧洲、亚洲人以5 4 位密码子突变为主，5 2 位密码子突变少见且种族差别不明显本研究所取样本除了要求为汉族外，为了控制各种疾病对各组研究结果的影响，要求各组研究对象不能出现入选条件重叠现象。
检测结果表明健康对照组、毛细支气管炎组、上呼吸道感染组的甘露聚糖结合凝集素第5 4 位密码子G T C 等位基因频率分别为0 ．1 2 、0 ．1 3 、0 ．1 5 ，3 组问无统计意义差别，所有研究对象总的G T C 等位基因频率约为0 ．1 6 ，说明甘露聚糖结合凝集素在第一外显子第5 4位密码子位点存在基因多态性目前较多文献报道【1 3 】’[ 3 5 】中国汉族健康人群的甘露聚糖结合凝集素第5 4 位密码子G T C 等位基因频率为0 ．1 l 到0 ．1 5 ，这与本研1 9中山大学M P H 学位论文M B L 基因多态性与婴幼儿呼吸道感染疾病的相关性研究究的甘露聚糖结合凝集素G T C 等位基因频率基本一致也有少部分文献报道的甘露聚糖结合凝集素5 4 位密码子G T C 等位基因频率与本研究结果相差较大，如王方勇4 0 等人报道的采用多聚酶链反应和单链构象多态性分析技术对1 6 6 名广东地区汉族人进行初步抽查，结果表明M B L 5 4 位密码子点突变频率为0 ．0 5 7 贾天军【4 1 1 等报道的采用多聚酶链反应和单链构象多态性分析技术对5 6 名汉族人进行检测，结果表明甘露聚糖结合凝集素基因5 4 位密码子点突变频率达0 ．2 3 ，可能与实验方法、条件不同等因素有关。