第三节 蛋白质的结构 蛋白质分子的构象与结构层次蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象一级结构： 氨基酸顺序 二级结构： α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲 三级结构： α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段 四级结构： 多亚基聚集蛋 白 质 结 构 的 主 要 层 次一级结构四级结构primary structuresecondary structureTertiary structurequariernary structure超二级结构结构域supersecondary structureStructure domain二级结构三级结构一 蛋白质的一级结构多肽链中氨基酸的连接方式和排列顺序，包括二硫键的位 置称为蛋白质的一级结构(primary structure)这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物 功能的信息 例：牛胰岛素的一级结构（一） 肽和肽键的结构肽： 一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物其中的氨基酸单位称氨基酸残基肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）， 肽单位：酰胺平面，肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链5肽 名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 写法： Ｎ Ser-Gly--Try-Ala---Leu C （或ＳＧＹＡＬ）对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但 目前只能测60个N端氨基酸。
两种以上特异性裂解法N CA 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 （二） 一级结构的测定 1.直接法基本战略：片段重叠法＋氨基酸顺序直测法 要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分b.测定肽键的N－末端和C－末端c.应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上 断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而 得到一系列大小不等的肽段d.分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序e.将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列① 化学裂解法溴化氰 —Met—X— 产率85%● 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化② 酶法裂解★ 胰蛋白酶 Lys —— X (X ≠ Pro) Arg —— X ★ 胰凝乳蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro) Trp——XPhe——X ★ 胃蛋白酶Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu)③ 肽段的分离纯化★ 电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根据分子量大小分离 ★ 离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离 ★ 反相ＨＰＬＣ法根据肽段的极性分离 ★ 凝胶过滤要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带ＨＰＬＣ单峰Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－Cl法）● 肽段序列测定及肽链的拼接① Edman法 A 耦联PITC ＋ H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃ PTC——A-B-C-D B 裂解 无水三氟乙酸（TFA）ATZ—A + H2N—B-C-D C 转化 PTH—APTC肽：苯氨基硫甲酰肽 ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸） ② DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
③ 有色Edman法荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’异硫氰酸酯④ 用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法● 肽段拼接成肽链16肽，Ｎ端H Ｃ端ＳＡ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWTＢ法裂解：SEO WTON VERL APS HO重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS2. 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）样品在质谱仪的离子源中通过一定的方式发生电离，形成带电的分子或分子碎片，再借助电场或磁场的作用使这些离子依质荷比（m/z）的不同获得分离，并按质荷比大小为序冲击检测器，从而得到质谱图，对样品进行鉴定3. 质谱法（Mass spectrometry-MS） 1886年发明质谱仪的离子源，1942年第一台商品化质谱仪问世，分析对象主要是小分子20世纪80年代电离质谱技术-电喷雾电离质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）两项技术使质谱技术发生了革命的变革，质谱技术真正走入了生命科学的研究领域m/z Acquired MS spectrumMS analysis of Peptide fingerprintingDatabaseSearchProtein ID1. 通过MS/MS分析确认 2. 搜索到的蛋白质分子量是否与胶上的一致 ? 3. 这个蛋白质是不是来自于你所期望的生物种？ 4. 这个蛋白质的等电点（pI）与你胶上相应的等电点是否一致？In-gel digestion With trypsinSteps in protein identification by mass spectrometryIn-gel digestion with trypsin PeptidesSpecific Protein spotProtein in DatabasePredicted peptides From hypothetical Trypsin treatmentPredicted MS spectrumAcquired MS spectrumThe protein is excised from a gel, in-gel tryptic digestion, andpeptide fingerprinting is then identified by Mass spectrometer(B) The MS Spectrum is then searched against theoretical mass spectra produced by computer-generated cleavage of proteins in the databaseProtein separation On gel electrophoresisSpecific protein In-gel digestion Is excised with trypsin MALDI-TOF analysisProtein Identification by MS/MSProtein PeptidesMS peptide spectrum 678.8678.8 679.3Selected Parent Ion MS/MSDatabase SearchSpecific protein identified 氨基保护：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、苄氧酰氯（CBZ-Cl）、 对甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。
羧基保护：苄酯、叔丁酯（成盐、成酯）羧基活化：酰氯法（PCL5）、叠氮法、混合酸酐法、 活化酯法缩合剂： DCCI（二环己基碳二亚胺）直接接肽（三）多肽与蛋白质的人工合成 二 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构（secondary structure）指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元．（一） 相邻肽键的空间结构 肽单位与α-碳原子的二面角肽平面★ 肽键的结构特点：（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个Cα几乎处在同一平面内（酰氨平面）4）肽键亚氨基在pH0---14内不解离5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型．酰胺平面与α-碳原子的二面角（ φ和ψ ）二面角两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角φ和ψ称作二面角，亦称构象角肽链的二面角★只有α碳原子连接的两个键（Cα—N和Cα-C） 是单键，能自由旋转★环绕Cα—N键旋转的角度为Φ环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ完全伸展的多肽主链构象α-碳原子酰胺平面Φ=00，ψ=00的多肽主链构象酰胺平面Φ=00，ψ=00侧链非键合原子 接触半径可允许的Φ和Ψ值Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻 肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ（二） 二级结构的基本类型 （1） α螺旋的一般特征：★ 多肽主链按右手或左手方向盘绕，形 成右手螺旋或左手螺旋，★ 相邻的螺圈之间形成链内氢键★ 构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ1 α－螺旋（α－helix）典型的α螺旋有如下特征：① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm ③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm④ 氨基酸残基侧链向外⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行⑥ 肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键典型的α螺旋用3.613表示， 3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基 13表示氢键封闭的环包括13个原子封闭环原子数=3n+4（n=1、2、.）（n：后边第n个aa）310 螺旋（n=2） 3.613螺旋（n=3） 4.316螺旋（n=4）310 3.613 4.316 n=2 n=3 n=4（2） R侧链对α—螺旋的影响① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α—螺旋。
如多聚Lys、多聚Glu② Gly在肽中连续存在时，不易形成α—螺旋③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋2 β－折叠（β-pleated sheet）两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同 肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形 成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片1）氢键与肽链的长轴接近垂直 （2）多肽主链呈锯齿状折叠构象 （3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧平行式： 所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向 反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同反平行β-折叠比平行的更稳定3 β-转角（β-turn）也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）球状蛋白质分子中出现的180°回折，由第一个aa 残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键β转角的特征：① 由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成② 主链骨架以180°返回折叠③ 第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键④ C1α与C4α之间距离小于0.7nm⑤ 多数由亲水氨基酸残基组成。
4 无规则卷曲（nonregular coil）无 规 则 卷 曲 示 意 图（三） 蛋白质的超二级结构蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个α－螺旋或β－折叠或β－转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：αα；β×β；βββ超二级结构（ supersecondary structure ）超二级结构类型βββααβ×ββαβ回形拓扑结构β -迂回（四）蛋白。