一、实验方案设计实验序号实验项目大肠杆菌生长曲线的测定实验时间2012. 6. 4实验室生化楼327 小组成员一.实验目的1. 通过对大肠杆菌生长曲线的测泄，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验的基本实验技能2. 巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板3. 掌握用比浊法测定细菌的生长曲线二.实验原理、实验流程或装置示意图将少呈:细菌接种到一怎体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一左时间测左培养液中 的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线它反映了单细胞微生物在一左 环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律依据英生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、 生长期、稳崔期和衰亡期将每一种一泄量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延 迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段延迟期：又叫调整期细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡） 此期曲线平坦稳左，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1〜 4小时此期中细菌体积增大，代活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代产物。
对数生长期：又称指数期此期生长曲线上活菌数直线上升细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几 小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素 的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳 量由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖 速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增赠数与死亡数渐趋平衡细菌形态、染色、生物活 性可岀现改变，并产生相应的代产物如外毒素、毒素、抗生素、以及芽抱等衰亡期：随着稳左期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多活菌数与培养时间呈反比关系，此期 细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形生理代活动趋于停滞故旧培养物上难以鉴别细菌体及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生 长曲线掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。
因此通过测立微生物的生长曲 线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义测左微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用本实验用比浊法测左，由于细菌悬 液的浓度与光密度（0D值）成正比，因此可利用分光光度讣测左菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测 的0D值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单三. 实验设备及材料大肠杆菌斜面菌种、营养肉汤培养基、生理盐水（0. 85%NaCl） 50mL. 721型分光光度汁、比色皿、恒温摇床、 培养箱、高压蒸汽火菌锅、电子天平、洒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶15个（250mL）、无菌吸管、烧 杯（1000mL〉、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等四. 实验方法步骤及注意事项实验步骤：配制营养肉汤培养基一►营养肉汤培养基火菌一►配制大肠杆菌菌液一 标i _►接种 ―►培养―►测定一^制生长曲线1. 配制营养肉汤培养基:用电子天平称取14. 4g营养肉汤粉末置于lOOOmL烧杯中，加水至800mL,用电炉加热（加热过程中要用玻璃棒不断搅拌）至沸腾后，冷却少许后分别倒进15个锥形瓶中，每个锥 形瓶倒50mL,塞上胶塞，用报纸包好，棉绳系好。
2. 营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121°C火菌30min.3. 配制大肠杆菌菌液：取大肠杆菌斜而菌种一支，在酒精灯火焰上方操作，用接种环刮取少量菌苔于约50mL生理盐水中，充分震荡均匀4. 标记:将15个锥形瓶进行标记，分别标号1、2、3……14、15.5. 接种:用ImL无菌移液管分别移取ImL大肠杆菌菌液到已编号的15个锥形瓶中，并充分震荡均匀.6. 培养:将锥形瓶巻于37°C下在恒温摇床上培养（150r/min）然后分别按对应时间将锥形瓶取出，待培养结朿时测定0D值7. 测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光光度计上调市零点，用蒸懾水作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测左，对浓度大的菌悬液用自来水适当稀释后测泄， 使其0D值在0. 1-0. 65之间，经稀释后测得的0D值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的0D值8. 绘制生长曲线:对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果五. 实验数据处理方法与原始记录实验数据处理方法：以时间为横坐标，ODq为纵坐标，用excel绘制大肠杆菌的生长曲线，分析实验结果实验数据原始记录：12345678 （3 倍）9 （4 倍）12:0013:0015:4518:0019:0020:0020:3021:0022:00ODeco 10. 0720. 0730. 0790. 2820.4561. 1051. 1690. 5540. 572OD600 20. 0730. 0730. 0790. 2820.4561. 1031. 1700. 5540. 571OD600 30. 0740. 0730. 0790. 2820.4561. 1061. 1660. 5540. 570平均0. 0730. 0730. 0790. 2820.4561. 1051. 1680. 5540. 57110 （4 倍）11 （4 倍）12 （4 倍）13 （5 倍）14 （5 倍）15 （5 倍）5 （6 倍）6 （6 倍）23:0000:001:002:006:208:3011:0012:00ODeco 10. 6420. 5030. 7510.5180. 6610. 5810. 5030. 5530D600 20. 6410. 5010. 7560. 5230. 6610. 5640. 5040. 5550D600 30. 6410. 5090. 7580. 5230. 6630. 5720. 5040. 555平均0. 6410. 5040. 7550. 5210. 6630. 5720. 5040. 554随时间的变化大肠杆菌液吸光度的数据（括号内数字表示稀释倍数）修正前的大肠杆菌的生长曲线图 修正后的大肠杆菌的生长曲线图时间/h013.756788.5910ODeoo0. 0730. 0730. 0790. 2820.4561. 1051. 1681.6622. 284时间/h1112131418.3320.52324ODeoo2. 5642.0163.0202. 6053.3152.8603.0243. 324修正前的大肠杆菌的吸光度数据时间/h013.756788.591011131&3320.5ODeoo0.0730.0730.0790.2820.4561.1051.1681.6622.2842.5643.0203.3152.86修正后的大肠杆菌的吸光度数据时间/h013.756788.5910110。
6000. 0730. 0730. 0790. 2820. 4561. 1051. 1681.6622. 2842. 564前12小时的大肠杆菌的吸光度数据前12小时的大肠杆菌的生长曲线图六. 参考文献[1] .牛天贵.食品微生物学实验技术.第1版•：科学，2010.[2] .革.微生物学实验教程.第2版.：科学，2010.[3] .何国庆，贾英民，丁立孝等.食品微生物学.第2版.：中国农业大学，2009.[4] .周徳庆，胡宝龙.微生物学实验教程.第2版.：高等教育，2006.七. 教师对实验方案设计的意见签名：年 月 日二、实验报告1. 实验现象与结果实验现象：随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，味道很难闻实验结果：大肠杆菌在培养基里生长繁殖，数量越来越多，达到一立数量后，增长速度变慢，后大肠杆菌进行营养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为02. 对实验现象、实验结果的分析及其结论分析：① 随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发岀来的味道也越来越浓，味道 很难闻，是因为大肠杆菌增长迅速，后来数疑达到顶峰，此时培养基的营养物质已被消耗殆尽，大 肠杆菌进行营养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。
② 通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解了细菌生长的特点，是:刚开始时细菌缓慢增长，后来增 长迅速，呈“J”型，最后细菌生长缓慢，数量达到顶峰，在一段时间保持不变因实验测量的时间不够介理等各种因素，因此用原始数据绘制岀来的大肠杆菌的生长曲线图不够有 规律，经修正后生长曲线比较好结论：细菌的生长曲线分为延缓期、生长期、稳左期和衰亡期体及自然界细菌的生长繁殖受机体免 疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线掌握细菌生长规 律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同因此通过测定微生 物的生长曲线，可了解细菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义三. 实验总结1. 本次实验成败及其原因分析总的来说，本实验算是成功的在一左程度生探讨出了大肠杆菌生长曲线的测龙通过此次试实验, 了解了细菌生长的特点，综合训练了微生物实验的基本实验技能巩固培养基的配制、火菌、仪器的包 扎、倒平板在一定程度上掌握了用比浊法测定细菌的生长曲线的方法但有两点不足:一是一开始忽略了 0D值必须在0. 10-0. 65之间才有效;二是时间的间隔不太合理，开 始的阶段应该时间安排紧密一点，还有晚上的一段数据没有测，实验时间不够长，延迟期和衰亡期曲线 不明显。
实验中若能考虑全而，这样测岀来的数据才更有代表性，更加准确2. 本实验的关键环节及改进措施本试验的关键环节有以下四点：① 整个过程最好是在无菌操作台上操作，这样培养基受空气中微生物的影响就较小，同时也可以减少污 染，保证培养基里大肠杆菌纯度较高，否则会在一泄程度上影响结果的准确性② 每隔半小时或一个小时（测量时间要安排合理，时间要控制好:在实验初期30min对菌悬液进行一次测 立实验中期每小时测一次，后期1〜。