ICTDTinTBCTCCTTirnCCCFCCTTTCFITCCTFCfiC=RTnB3 TLiTiC RRfl 肝QIFMHST网匚丽回CEF FHH^TCHTMIflftC TTMCMIZ70 80 9D 1OQ 110 120 13 140 I 5D 11* "'—i SiPCR杂带测序结果的判读测序结果为.abi格式，可用软件chrosmas打开，一种颜色的峰代表一个碱基，峰的高低表默认的值，机器会认为该处有两个峰，因此不能判断确定是哪个峰，需要人工判读以下三质粒污染(Two plasmid)AFSrrt 1!^ FF7 Alt：? 6 FH7 A 19DATTJfCT21DH TTTTG T后G 后 E *「223 2 知 240 5信号的强弱一个正常的N表示机器没法判读是哪种碱基，原因是:杂峰的信号高于机器种情况会出现N：有杂合子，有杂峰，反应已结束350 GCGCrCTCCT3BD GTTCCGACCCTO-C C 0- C T r割胶纯化后测序产物纯化X； nx- e-Xiz+j —tb ■:SXX--" P—J 皿中原因：测序产物纯化不够注意：染料峰位于序列的前100碱基以内;酒精峰位于序列的220 ~ 320碱基之间产生的原因是样品或毛细管内有灰尘等固体小颗粒原因：测序反应失败。
解决办法：改进条件，重做反应注意两个关键因素：引物与模板之间的比例：3.2 pmol:200 ng模板DNA的纯度和用量：1.6 ~ 2.0T峰特别弱原因：残余的Dye太多，纯化不够有测序反应，但效率低下信号太弱 解决办法：纯化充分避开引物峰，确定新的分析起点1、PCR产物测序时出现重叠峰问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）―SQ C C T fl T QGT - OCGCTT CHTTTTH{|GNQ
解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化2、克隆测序时出现峰形重叠原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染解决方法：重新挑单克隆的菌落伐U线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序3、样品有杂合/突变位点模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的 杂合位点如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位黑占一般都是罩一的峰形，然 后突然在某一侗位黑占出现重叠峰（如图中箭^所示）解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序进行测序RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；或者构建载体5、基因中含有重复序列可能的原因:样品中含有重愎序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame 滑动，较短的重愎序列会导致测序结果出现移码；而较长的重愎序列会使定序信号衰减解决办法:反向测序有时能够顺利的通过重愎序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序 结果比对，拼接可以得到全序列结果。