水质微生物分析及评价实验方案一、实验目的（1） 通过对水中细菌数量及大肠杆菌数量的检测来评价水质好坏2） 培养自主创新实验设计及团队合作能力3） 对所学知识进行实际应用及归纳复习2、实验内容（1）利用平板菌落计数技术测定水中细菌总数2）多管发酵法检测大肠杆菌3）细菌菌落观察及形态描述4）细菌的个体形态鉴定（细菌的单染色、革兰氏染色、生理生化鉴定） 3、相关资料水中主要存在的污染水质的细菌是大肠菌群，主要有耐热大肠菌群及大肠埃希氏菌（大肠杆菌） ，对水质的测定一般是检测细菌总数、总大肠菌群经查资料得知，自来水中，细菌总数每毫升不能超过 100 个，大肠菌群不能超过 3 个/升水中出现了大肠菌群大于3 个/升说明水源已经被污染细菌总数是指水样在一定条件下培养后所得 1ml 水样所含菌落的总数总大肠菌群系指一群在 37℃培养 24h 能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量水中总大肠菌群数系以 100ml 水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示按国家饮用水卫生标准规定，1 毫升自来水中杂菌数不得超过100 个，大肠菌群数 1000 毫升水中不得超过 3 个才算合格。
4、检测（一）细菌数量检测1、原理由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有细菌都能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出水中细菌总数仅是一种近似值一般采用牛肉膏蛋白胨培养基培养2、材料准备牛肉膏蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基、乳糖蛋白胨培养基、酒精灯、棉签、试管（多个）、培养皿（多个）、无菌广口瓶（锥形瓶）、高压蒸汽锅、天平、纱布、报纸、细绳、接种环等牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000ml；伊红美蓝培养基配方：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20-30g、蒸馏水1000ml、2%伊红水溶液20ml、0.5%美兰水溶液13ml；乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨20g、溴甲酚紫0.01g、乳糖10g、水1000ml）3、操作方法（1） 采样：瓶装纯净水、自来水、河水取样方法：自来水：将自来水水龙头用火焰灼烧 3min 灭菌，再拧开水龙头流水5min，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角瓶取水样河水：将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面 10-15cm 深的水层中，；瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测。
或临时保存于冰箱，但不超过 24h2） 细菌总数检查：1）自来水、纯净水吸取 1ml 水样，分别在牛肉膏蛋白胨培养基中培养 37 度恒温箱中，培养 24h 计数，每组设计一个空白试验对照组2）河水采用平板菌落计数法：一般中等污秽的水样可取 10、100、1000 三个稀释度，严重污秽水样取 100、1000、10000 三个稀释度之后的步骤重复以上）3）计数方法1、计算相同稀释度的平均菌落数有大片菌苔生长时弃用，以无片生长的平皿计数；若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半数×22、选择菌落数在 30-300 之间的平板，只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘以稀释倍数有两个在 30-300 时，按两者菌落总数比值决定：比值小于 2，取平均；比值大于 2，取较小的菌落总数所有菌落大于 300，取稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；所有菌落小于 30，取稀释度最小的平均菌落数乘以稀释倍数；所有菌落都不在 30-300 间，取接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数）（2）大肠菌群数检查1、原理水中的病原菌多来源于病人和病畜的粪便由于病原菌数量少，检测过程复杂因此，直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠杆菌在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相似，并且检验方法简易，因此一般作为水质检测的标志大肠杆菌群是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，24 小时内能发酵乳糖或半乳糖多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵初发酵中大肠杆菌群发酵乳糖产酸，产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性平板分离一般利用大肠杆菌群在伊红美蓝琼脂上形成深红色或紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断最后用复发酵进一步证实2、多管发酵试验操作步骤（1）取 5 支装有乳糖蛋白胨培养基的发酵管，每管分别加入河水水样 10ml，另取 5 支装有乳糖蛋白胨培养基的发酵管，每管加入河水水样 1ml以同样方式取自来水与矿泉水 10ml，分别加入 5 支乳糖蛋白胨培养基的发酵管做好标签2）取出培养后的发酵管，观察管内发酵液颜色变为黄色为产酸，杜氏小管内有气泡为产气将产酸产气与只产酸的两类液体接种于伊红美蓝培养基上，37℃恒温箱中培养 24 小时挑选深紫黑色和紫黑色带有或不带有金属光泽的菌落、或淡紫红色和中心较深的菌落，将其一部分分别取样进行涂片和革兰氏染色观察分离培养）（3）若经镜检证实为格革兰氏阴性无芽孢杆菌，则将此菌落的另一部分接种于装有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培养液的复发酵管中，每管可接种同一发酵管的典型菌落 1-3 个，37℃培养 24 小时，若为产酸产气则表明试管内有大肠菌群存在，记录为阳性管。
验证试验）（4）根据每类水中不同浓度的试管中出现阳性管数，计算 1L水样中的大肠菌群数计数）（5） 将检测得到的每升水样细菌总数和大肠菌群的菌落个数与标准水质的指标相比较，看水质是否被污染，污染是否严重 （比较分析）五、菌落形态的观察及描述对培养基上的细菌进行观察和描述（形状、大小、表面粗细、边缘形状、颜色、质地、透明度、软硬等） 6、细菌的个体形态鉴定（1）细菌的单染色1.原理（1）单染色：由于细菌在中性、弱酸性或碱性中带负电荷，碱性染料在电离后染色离子带正电荷，因此使细菌着色2）油镜镜检：油镜的放大倍数可达 100X，但其焦距和直径很小，需要很大的光照强度当镜与装片之间的介质是空气时，由于空气与玻璃的折射率不同，透过载玻片的光线有一部分因折射不能进入镜头，降低了视野的照明度当以香柏油为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，从而提高视野的照明度和分辨率2 材料及用具二甲苯、香柏油、番红染液、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸3、操作步骤流程：涂片—干燥—固定—染色—水洗—干燥—镜检（1）涂片取两个洁净无脂的载玻片，于中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑去少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜。
2）干燥将涂片于室温中自然干燥3）固定夹住载片一端使涂菌的一面朝上，载片通过微火 2 或 3 次，以不烫手为宜4）染色涂片置于水平位置，滴加番红染液覆盖涂菌处，染色 2min5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水冲洗，不得直接冲在涂菌处，洗至流下的水中无染色液的颜色为止6）干燥用吸水纸轻轻吸干7）镜检油镜镜检（二）革兰氏染色1、原理革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色；而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色2、材料及用具二甲苯、香柏油、结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染液、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸3、操作步骤流程：涂菌—干燥 —固定—初染—媒染—脱色 —复染—镜检 （1）涂菌取两块载玻片，在中央各滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从菌种斜面挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂片2）干燥于空气中自然干燥为了加速干燥，可以把玻片置于火焰上部略加温。
3）固定涂面朝上，通过火焰 3 次，以热而不烫为宜使细胞质凝固从而使细胞形态固定，并使细菌黏附在玻片上4）初染于制片上滴加结晶紫染液，1min 后洗去染料5）媒染滴加卢哥氏碘液，1min 后用水洗去6）脱色滴加 95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再有紫色脱落为止，立即用水冲洗7）复染滴加番红染液复染 1min，用水洗去8）镜检滤纸吸干，油镜镜检3）细菌的生理生化鉴定1.原理（1）各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显不同细菌分解、利用脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统2）某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，吲哚与二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚阳性反应3）微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，继续脱羧形成乙酰基甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类，肌酸类物质反应，形成红色化合物，为 V-P 反应阳性4）有些细菌发酵糖类产生的有机酸较多，使发酵液的 PH 下降到4.2 以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红，为甲基红反应阳性5）某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。
2、实验材料（1 ）菌种：河水微生物培养斜面接种菌（2 ）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基（葡萄糖 0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾 0.2g，水 100mL） 、蛋白胨水培养基(蛋白胨 1g，氯化钠 0.5g，水 100mL)、糖发酵培养基（蛋白胨 6g，葡萄糖、乳糖或蔗糖 3g，水 100ml）（3 ）试剂：40％NaOH，溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基，酚紫指示剂4）器具：超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管3.操作步骤流程：糖发酵试验→V-P 试验→甲基红试验→吲哚试验一) 糖类发酵试验经培养后根据指示剂的颜色变化来判断是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察流程：发酵液试管→ 标记→ 接种 →培养→观察→记录试管标记→糖发酵产气→接种培养→观察结果二）乙酰甲基甲醇试验(V．P 试验) 试管标记→接种培养→记录观察三）甲基红实验于 v-p 试验留下的培养基中，分别加入 2-3 滴甲基红指示剂，观察结果，红色为阳性反应，橘黄或黄色，阴性，橘红色为弱阳性四）吲哚试验试管标记→接种培养→观察记录 。