单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,乙型肝炎病毒cccDNA,检测方法与应用价值,一、几个相关问题简介,什么是HBV cccDNA?,即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并,建立,感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用,宿主,DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子乙型肝炎病毒基因组结构示意图,乙型肝炎病毒的复制过程,我们为什么要关注HBV cccDNA?,cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”,目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA,的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治,疗后容易复发的原因之一,肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏,移植术后乙肝复发的来源,还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世,为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?,研究和开发该检测技术的时间不长,检测技术上的难度较大,前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏,模，不能满足临床检验的需求,现有技术灵敏度不高，检测低限10,4,copy,/ml左右,分研究机构和学者对检测技术的特异性认,识不足，存在缺陷,多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、,rcDNA、ssDNA、整合的HBV DNA），必须有,效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA,如何进一步解决特异性的问题？,如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA,含量的较低），血清中含量？,如何简化检测步骤？,建立cccDNA检测技术必须克服的难点,cccDNA,rcDNA,核酸一级结构,完整的双链,两条链均不完整,核酸空间结构,闭合环状，超螺旋,松弛环状，非超螺旋,是否与蛋白质结合,不结合,共价结合,对某些核酸酶抗性,强，不容易被降解,弱，容易被降解,分离cccDNA和rcDNA的分子基础,分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异,二、HBV cccDNA检测技术,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR),2.侵入者探针法（Invader assaay）,3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,现有的几种cccDNA检测技术简介,选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR),2.侵入者探针法（Invader assaay）,3.嵌合引物荧光PCR法,设计一对特殊引物：跨,双,缺口引物,正义引物P1：与负链互补结合，位于正,链缺口上游,反义引物P2：与正链互补结合，位于负,链缺口下游,目的：rcDNA不被扩增,1.选择性PCR,选择性PCR：rcDNA不被扩增,选择性PCR：cccDNA能被扩增,PCR产物自身退火（self annealing）,“选择性”PCR：并非万无一失,rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠,Hepatology,Research 2003;15:234-243,（,PBMC,）,World J,Gastroenterol,2004;10(1):82-85(,血清,),Kock,等：反应管中,rcDNA,含量不能超过,10,5,copy,Hepatology,1996;23:405-413,血清HBV rcDNA超过10,8,copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性,“选择性”PCR：并非万无一失,与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。
选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,rcDNA,不能被扩增,无荧光信号,EcoR I,5,+,P1,P2,3200(1),5,3,1590,3,1820,P1,1820,1590,+,3200（1）,EcoR I,P2,cccDNA能被扩增,检测到荧光信号,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,实时荧光定量PCR的原理,标准曲线方程,Y,Ct,copy,相关指数：,R,2,=0.995,灵敏度至少可以达到,10,3,copy/ml,结果：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA,非特异性扩增的问题,由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普,通PCR更高,缺陷：,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,质粒标准品10,7,copy/ml,3.510,8,copy/ml携带者血清,质粒标准品10,5,copy/ml,10,5,10,7,copy/ml携带者血清,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,解决方案,特异性抽提分离,cccDNA,与其它形式的病毒,DNA,采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法,酶切纯化,cccDNA,采用绿豆核酸酶或,ATP,依赖的,plasmid-safe DNA,酶,选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR),侵入者探针法（Invader assaay）,3.嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,2.侵入者探针法(Invader assay),两个体系：,两种特殊的探针：invader probe和primary probe，后者含与待测模板无关的5侧翼的碱基片段。
荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶(cleavase,裂解酶)特异地切割5侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号特点：,一个模板可以重复使用，每“结合裂解结合裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大,侵入者探针法,定量检测cccDNA的优缺点,优点,：线性信号放大，特异性比荧光,PCR法强,缺点,：灵敏度低：10,4,copy/ml,1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR),2.侵入者分析法（Invader assaay）,嵌合引物荧光PCR法,现有的几种cccDNA检测技术简介,3.,嵌合引物荧光PCR法,Shao,et al.J Virol Methods 2003,；,112,：,45-52,+,P,N,N：与HBVDNA非同源片段,5,N,5,3,3,p,+,rcDNA,cccDNA,P,N,N,P2,5,3,5,3,3.,嵌合引物荧光PCR法,嵌合引物荧光PCR的优缺点,优点：,克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏,度比侵入法提高,缺点：,仍不能完全避免待测标本中存在的,rcDNA被非特异性扩增,无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。
三、影响cccDNA池的因素,1.cccDNA池的自身恒定,cccDNA池：感染肝细胞核内HBV cccDNA的,含量在无外来干扰的情况下保,持恒定(550copy/cell),病毒自身调节：关于病毒的进化,关于病毒的“思维”,病毒自身的调节,外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果,2.抗病毒药物对cccDNA的影响,现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少,cccDNA,，但均不能清除,cccDNA,细胞核内,cccDNA,含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性,3.肝外组织也是cccDNA的储存池？,肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：,肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏,膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺,等组织或细胞中均检测到HBV的标志物,HBV吸附？暂居？建立感染状态？,依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，,但必须解决检测技术问题,(2)关于血清中是否存在cccDNA的问题,“血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率,越高和含量越高”的现象，使我们对方法,学提出质疑,肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放,cccDNA入血,细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的，,但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少,时间？,Thank you,。