细菌的人工培养 人工制备营养充足的培养基并提供适宜的温度、气体、pH等培养条件，即能使细菌在体外环境迅速生长繁殖细菌培养对临床上病原菌的分离鉴定、制备抗生素、制备疫苗等生物制品都是必不可少的 一、培养基的制备原则： 1、必须有充足的营养 2、合适的酸碱度 3、绝对无菌 二、培养基的制备 培养基是用人工方法将多种营养物质按照各类微生物生长的需要而合成的一种混合营养料 常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等 按照培养基的物理性状可分为液体，固体和半固体三类 以下介绍常用基础培养基的制备 （一）肉汤培养基： 制法：称取营养肉汤粉1.8g（含牛肉膏0.3克g，蛋白胨1g、氯化钠0.5g）加入100ml蒸馏水中，用玻棒搅拌加热溶解按需要分装于三角瓶或试管，瓶口或管口塞棉塞，包装后置高压蒸汽灭菌器内，在0.11Mpa（1.05公斤/厘米2）压力下，温度达1210C，维持15～20分钟冷却后贴好标签，40C冰箱贮存备用 制成后的肉汤呈浅黄色，清晰透明，pH 7.1+0.2 肉汤培养基常用于增菌培养 （二）肉汤琼脂固体培养基： 在上述肉汤培养基中加入2～3%琼脂即成。
经高压灭菌后，趁热将试管斜置、冷凝，即成普通琼脂斜面培养基；或趁热取出后，稍冷，以无菌操作倾入灭菌的空培养皿，冷凝后即为普通琼脂平板制作琼脂平板时，每一空皿（9厘米直径）需培养基15～20ml 普通琼脂平板用于分离培养繁殖细菌；普通琼脂斜面用于纯培养和保存菌种琼脂是从石花菜等海藻类中提取的多糖物质，当温度达到98℃以上可溶化，45℃以下则凝固琼脂对细菌一般无营养作用，用做斜面、平板、高层等不同类型固体培养基的凝固剂琼脂通常呈酸性，加入液体培养基中可使酸碱度下降pH 0.2左右三）肉汤琼脂半固体培养基： 在上述肉汤培养基中加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，分装于小试管（10×100mm），每管约3ml，高压灭菌后直立冷凝即成 半固体培养基用于检查细菌的动力和细菌菌种的保存 三、常用培养基介绍 （一）基础培养基 基础培养基含有大多数细菌生长繁殖时所需要的氮源、碳源、无机盐类、水份等最基本的营养成份，可供大多数细菌生长，并可作为营养、鉴别及选择培养基的基础原料常用的如肉汤培养基 （二）营养培养基 在基础培养基中添加一些其他的营养物质，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、生长因子等，可供培养营养要求较高的细菌。
例如血琼脂平板、血清肉汤培养基等 （三）鉴别培养基 利用各种细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物，观察细菌在其中生长后分解底物的作用，从而鉴别和鉴定细菌例如，单糖发酵管就是在无糖的基础培养基（蛋白胨水）中加入某种糖类及指示剂，因不同细菌对各种糖类发酵作用不同而鉴别之 （四）选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，使之抑制某一类细菌生长，而有利于另一类细菌生长，从而将后者筛选出来，常用在含有杂菌的标本中分离某种致病菌，例如SS琼脂平板 （五）厌氧培养基（见实验十-厌氧性细菌，P.80） 四、细菌的接种技术和培养方法： 一般细菌都可用人工方法进行培养，以进一步研究它们的各种生物学特性培养细菌时，根据研究目的和细菌生长条件的差异，需采用不同的接种技术和培养方法 （一）细菌的接种技术 接种技术一般分为分离培养接种法和纯种细菌接种法，正确的接种技术是获得典型的生长良好的细菌培养物所必需的1、 分离培养接种法---平板划线法： 被检材料如粪便、痰、脓汁、尿液、脑脊液等常混杂有多种细菌，平板划线法可使混杂的细菌在琼脂平板表面分散生长，各自形成不同的菌落，再根据菌落的形态特征，挑选单个菌落继续培养，以此分离获得纯种细菌，用于进一步研究、鉴定或保存。
平板划线的方法根据待检标本中细菌的数量来选择，可分为平行划线法和分区划线法两大类 【材料】葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液、普通琼脂平板 【方法】 （1）平行划线法：常用于含菌量较少的标本 ①烧灼接种环，待冷，取一接种环菌液左手斜持平皿（450角），用拇指打开皿盖，使其与皿底间分开成2～3cm宽的缝隙，靠近火焰周围，右手握持沾菌之接种环伸入皿内，在平皿上端1/6范围来回划线，密集涂布 ②烧灼接种环，待冷后（是否冷却可在平板培养基边缘无菌处接触一下，若琼脂溶化表示尚未冷却），通过原划线处作连续平行划线（如图2-1A）划线时使接种环与平板成300～400角，轻触平板，用腕力将接种环在平板表面行轻快的滑移动作来回划线，划线间距适当，不能重叠，接种环也不能嵌入培养基内划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染 ③接种完毕后，盖皿盖，将接种环火焰灭菌后放回，用记号笔在皿底玻璃上注明标本名称，接种者班级、姓名、日期等，将培养皿倒置（平皿底面朝上，以避免培养过程中凝结水自皿盖滴下），送进温箱 ④经37℃18～24小时孵育后取出，观察琼脂平板表面细菌生长情况，注意菌落的特征 （2）分区划线法：用于含菌量较多的标本。
同上法通过原划线处作连接平行划线，划线范围占平板的1/3～1/5；种毕, 旋转平板，接种环用火焰灭菌，冷却，再通过前一段划线在平板另1/3～1/5面积内作连续平行划线；如此重复3～5次（如图2-1B和2-1C） 接种完毕后，盖皿盖，接种环火焰灭菌后放回同上在皿底玻璃上注字后，将培养皿倒置，送进温箱培养，37℃18～24小时后取出，观察菌落特征2、纯种细菌接种法细菌分离成纯种细菌后，常需接种至各种有关培养基，以扩大繁殖，做进一步鉴定根据培养基的物理性状，纯种接种法有斜面培养基接种法，液体培养基接种法和半固体培养基接种法三类材料】葡萄球菌或大肠杆菌18～24小时斜面培养物各一支、固体琼脂斜面培养基、肉汤培养基、半固体琼脂培养基方法】（1）固体斜面培养基接种法：①左手握持菌种管与待种培养管的下端，使斜面部向上，两管口平齐在火焰旁，以右手手掌与小指、小指与无名指分别拔取并夹持两管棉塞，并将两管管口迅速通过火焰灭菌②右手执接种环（姿势与握铅笔相似）火焰烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分，亦要通过火焰3次以杀灭其表面的杂菌灭菌过的接种环要握持手中，勿再碰及其它物品③将灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许，退出菌种管，再伸进待种管中，自斜面底部轻轻向顶端划一直线，然后自下而上沿斜面蜿蜒划线，注意划线时勿划破培养基表面，沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。
如图2-2）④接种完毕，两管管口迅速通过火焰2～3次，塞回棉塞，并以右手拇指、食指分别将两管棉塞转进至原来位置接种环灭菌后送回接种管注字后37℃孵育18～24小时后观察生长情况图2-2 斜面接种法示意图图2-3 液体培养基接种法 （2）液体培养基接种法： 基本上同固体斜面接种法，不同处，仅在取菌后，接种环应在液体培养基管接近液面的管壁处轻轻研磨均匀（如图2-3），然后将试管稍倾斜，使菌种混匀于肉汤中即可 （3）半固体培养基接种法： ①同上法握好菌种管及半固体培养基管 ②右手握持接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔，垂直刺入半固体琼脂培养基的中心，可刺达近管底处，但不触及管底，然后循原路退出 ③接种毕，管口通过火焰灭菌，塞上棉塞，接种针灭菌后放回（如图2-4） 上述纯种细菌接种后，均要在试管上注明菌名、接种者姓名、日期，送入37℃温箱，培养18～24小时后观察生长情况二）细菌的培养法： 根据待检细菌的生物学特性和培养目的，可选择采用一般培养法、二氧化碳培养法及厌氧培养法 1、一般培养法： 又称需氧培养法将已接种好的平板、斜面、液体培养基置于37℃恒温孵育箱中，经18～24小时培养后，一般可于培养基上长成肉眼可见的培养物。
如菌量很少或生长缓慢的细菌则需培养3～7天甚至1个月才可见培养物生长 2、二氧化碳培养法： 某些细菌如脑膜炎球菌，淋球菌及肺炎链球菌等培养于含有5～10％二氧化碳环境下才能迅速生长，尤其是自标本中初次分离时更为重要为使培养环境中含5～10％二氧化碳，常用方法有下列二种： （1）烛缸法：此为一手续简便而效果良好的方法 A、取一具有严密瓶盖的玻璃干燥器，将已接种细菌的试验管或培养皿等置于此玻璃器内 B、取普通蜡烛一短段，将其点燃，并将蜡烛粘附于器内 C、随即将器盖加凡士林油严密盖紧，切勿漏气，此时蜡烛火焰之上端与盖底必须保持适当距离（一般离开约10cm即可），以免火焰烧灼盖底引起炸裂 D、容器内的蜡烛一般于30～60秒间即熄灭，此时容器内的二氧化碳约占10％左右 E、将玻璃干燥器置于37℃温箱内培养 （2）硫酸与碳酸钠法 A、将已接种细菌的试管或培养皿置于一有密闭盖的容器内 B、取原盛青霉素的空瓶或其它玻瓶一个置于此容器内 C、估计此容器内部容积，将适量碳酸钠粉末加于此小瓶内，然后再加入适量10％硫酸溶液，使与碳酸钠粉末混合，例如容器容积为l000ml，则加入无水碳酸钠0.24g与10％硫酸溶液4ml，即产生所需的二氧化碳。
D、待反应发生后，将盖严密盖紧 E、将此容器置于37℃温箱内培养 3、厌氧培养法五、细菌的生长情况观察 细菌的种类不同，其生长情况也有差别，因而观察细菌的生长情况，对于研究鉴别细菌很重要下面介绍几种细菌生长情况的观察方法 （一）细菌在固体琼脂平板上生长情况的观察 【材料】 1、普通琼脂平板分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、变形杆菌 2、血琼脂平板分别接种金黄色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌 【方法】 选择细菌分散生长，形成单个菌落区域中的菌落进行观察菌落为鉴定细菌的重要指标之一，观察项目主要有以下几点 （1）大小：菌落直径通常以实测mm数表示，也可按习惯描述为针尖大、粟粒大等 大菌落：直径4～6mm或大于6mm； 中等菌落：直径2～4mm 小菌落：直径1～2mm； 细小菌落：直径小于1mm； （2）形状：圆形、卵圆形、叶状、不规则形、放射状等 （3）颜色：无色、白色、黄色、绿色、褐色等色素有脂溶性和水溶性两种，脂溶性仅菌落有颜色，培养基不着色；水溶性则菌落和培养基均着色如色素不明显，可用滤纸条轻轻沾菌落表面，如有色素产生，可使滤纸染成相应颜色（沾有细菌的滤纸条观察后投入消毒缸里）。
有的鉴别和选择培养基，在细菌生长过程中形成一定颜色，如大肠杆菌在中国蓝培养基上形成蓝色菌落，而在S-S琼脂培养基上形成红色菌落，这是由于大肠杆菌发酵乳糖产酸，借指示剂而显色，与细菌本身产生色素不同 （4）表面：凸起、扁平、中心凹陷等；光滑、粗糙、皱纹、颗粒状等；湿润（有光泽）、干燥（无光泽）等； （5）边缘：整齐、不整齐（可有颗粒样，羽毛样、锯齿状、毛发状等）； （6）透明度：透明、半透明、不透明等； （7）溶血性：指细菌于血琼脂培养基上对其周围血液的溶解情况，可分为完全溶血（β型溶血），不完全溶血（α型溶血）和不溶血 （8）迁徙生长现象 根据以上观察特点，可将菌落分为三个类型： 1、光滑型菌落（Smooth type Colony）：又称S型菌落，此种菌落特点为表面光滑、湿润、边缘整齐、至于其它特点如凸起或扁平、色素、透明度、溶血等可因菌种而异 2、粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型菌落，此种菌落表面粗糙、干燥、边缘不整齐 3、粘液型菌落（Mucoid type Colony）：又称M型菌落，此型菌落表面光滑。