光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较(一) 、透射电子显微镜1、基本原理在光学显微镜下无法看清小于0.2如的细微结构，这些结构称为亚显微结构(submicroscopic structures)或超微结构(ultramicroscopic structures ； ultr as true tu res)要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分 辨率1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射 电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短目前TEM的分辨力可达0.2nm电子显微镜(图2-12)与光学显微镜的成像原理基本一 样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜另外，由于电子束的穿透力很弱, 因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片这种切片需要用超薄切片机(ul tr amicro to me)制作电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
表2 2不同光源的波长名 称可见光紫外光 X射线a射线电子束0.1Kv 10Kv波长(nm)390~76013~390 0.05~130.005~10.123 0.0122扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)于20世纪60年代问世，用来 观察标本的表面结构其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级 电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由 探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控 制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像图像为立体形象，反映了标 本的表面结构为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金 属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号目前扫描电镜(SEM)的分辨力为6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点， 则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X电子显微镜技术目前，电子显微镜技术(electronmicroscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段常 用的有透射电镜(transmission electron microscope， TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)。
与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像成像原理1、 透射电镜技术（TEM）透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相 底片上进行观察透射电镜的分辨率为0.1〜0.2nm,放大倍数为几万〜几十万倍由于电子 易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50〜100nm）其制备 过程与石蜡切片相似，但要求极严格要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小（1立方 毫米以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋，用特制的超薄切片机 （ul tr amicro tome）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束 投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子 照片上则呈黑色称电子密度高（electron dense）反之，则称为电子密度低（electron lucent）2、 扫描电镜术扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集， 形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。
细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成 照片扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后，再于样品表面喷镀薄层金 膜，以增加二波电子数扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm左右 的凹凸不平面能清所成像，故放样品图像富有立体感扫描电子显微镜扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了1942年，英国首 先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值 不大经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到1956年开 始生产商品扫描电镜近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科 的领域中，促进了各有关学科的发展一. 扫描电镜的特点和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：（一） 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mmX80mmX50mmo（二） 样品制备过程简单，不用切成薄片三） 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察四） 景深大，图象富有立体感扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十 倍五）图象的放大范围广，分辨率也比较高。
可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm六） 电子束对样品的损伤与污染程度较小七） 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析二. 扫描电镜的结构和工作原理（一） 结构1. 镜筒镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统其作用是产生很细的电子束（直径约几个 nm）,并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号2. 电子信号的收集与处理系统在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背 散射电子、X射线、吸收电子、俄歇（Auger）电子等在上述信号中，最主要的是二次电子， 它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至几 十 nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分通常所说的扫描电镜像指的就是二次 电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号检测二次电子的检测器（图15（2）的探 头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电 倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信 号，最后被送到显像管的栅极。
3. 电子信号的显示与记录系统扫描电镜的图象显示在阴极射线管（显像管）上，并由照相机拍照记录显像管有两个， 一个用来观察，分辨率较低，是长余辉的管子；另一个用来照相记录，分辨率较高，是短余 辉的管子4. 真空系统及电源系统扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成，其作用是使镜筒内达到10（4〜10（5托的 真空度电源系统供给各部件所需的特定的电源二） 工作原理从电子枪阴极发出的直径20（m〜30（m的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射 向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针在物镜上部的 扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号这些电子 信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上 并且调制显像管的亮度显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动 与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描 电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征第二节扫描电镜生物样品制备技术大多数 生物样品都含有水分，而且比较柔软，因此，在进行扫描电镜观察前,要对样品作相应的处 理。
扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能一. 样品的初步处理（一） 取材取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，可参考第十四章超薄切片技术中所提的要求 但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mmX8mm，厚度可达5mm对于易卷曲 的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面二） 样品的清洗用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面由于样品取自活体组织， 其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察因此，在样品 固定之前，要将这些附着物清洗干净清洗的方法有以下几种：1. 用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；2•用5%的苏打水清洗；3. 用超声震荡或酶消化的方法进行处理例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法： 清洗液配方：透明质酸酶300 （g a 一糜蛋白酶10 mg生理盐水100 ml清洗液的pH为5.5〜6清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水 洗3次无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品三） 固定固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。
由于样品体积较 大，固定时间应适当延长也可用快速冷冻固定四） 脱水样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯 作中间液二. 样品的干燥扫描电镜观察样品要求在高真空中进行无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧 烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构因此，样品在用电镜观 察之前必须进行干燥干燥的方法有以下几种：（一） 空气干燥法空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐 挥发干燥这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组 织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形因此，该方法一般只适用于表面较 为坚硬的样品二） 临界点干燥法临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全 汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的这样就可以避免表面张力的影响，较好 地保存样品的微细结构此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2〜3小时即可完成，所以是最为常用的干燥方法但用此法，需要特殊仪器设备临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：1. 固定、脱水：按常规方法进行。
如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮 置换15〜20分钟2. 转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15〜30分钟3. 移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品 室内，盖上盖并拧紧以防漏气4. 用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31(C, 72.8大气压)后，将温度再升 高10(C，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥三) 冷冻干燥法冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的 过程冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液 态,不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤 冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥1 •含水样品直接冷冻干燥法1.1取材固定：按常规方法进行1.2置于冷冻保护剂中:将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时常用的冷冻保护剂为10%〜20% 二甲基亚砜水溶液，或15%〜40%甘油水溶液1.3骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(。