第四章第四章 菌种选育菌种选育•利用工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平高低最主要的有三个方面的因素：生产菌种，发酵工艺和后提取工艺其中最重要的是生产菌种•菌种选育的最初目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求 菌种选育的目的 菌种选育的基本内容 •根据菌种自然变异而进行的自然选育，以及用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种，再按照工业生产的要求进行筛选来获得新的变种或杂种 菌种选育技术 •自然选育、诱变育种等方法属于经验育种的范畴 ；•原生质体技术、杂交育种、分子生物学方法等现代菌种选育技术 第一节 自然选育•自然选育自然选育•是一种纯种选育的方法它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰退型菌株，从中选择维持原有生产水平的菌株 一、自然选育的目的一、自然选育的目的•1.纯化菌种•2.防止菌种衰退•3.稳定生产•4.提高产量 一、菌种退化与变异原因一、菌种退化与变异原因 •1．菌种遗传特性的改变．菌种遗传特性的改变•（1）遗传基因型的分离• 异核体现象•（2）自发突变（回复突变）•自发突变的原因：•①用沙土管等长期保藏；•②菌种连续传代，这种自发突变比保藏过程中产生的比例要高；•③活细胞内进行的新陈代谢活动，能产生一些具有诱变作用的物质，当这些物质在胞内累积到一定浓度时能诱发DNA结构的改变。
•④DNA中存在的增变基因也能诱发基因突变•⑤有的微生物的染色体上还存在有导致菌体退化的死亡基因，DNA的代谢失调也会引起基因突变而造成菌种退化•⑥多因素低剂量的诱变效应•⑦互变异构效应 2．经诱变剂处理后的退化变异．经诱变剂处理后的退化变异 •①初筛出的菌落可能是由成对或成堆孢子发育成的，其中只有一个细胞诱发了基因突变，在传代中细胞核分裂时，未发生基因突变的细胞逐渐在数量上占优势，便表现出产量下降•②可能是诱变菌种的细胞是异核体，而发生基因突变的只是其中一个细胞核的遗传基因那么在传代过程中由于产生细胞核的分离现象，高产突变基因的核在数量上失去了优势，便出现产量性状的退化变异•③突变发生在无意义链上，在遗传信息传递过程中被丢失，致使正突变性状的消失•④在诱变剂的作用下，被诱变菌种出现基因混杂，突变的高产基因虽然已经传递到下一代，但在传代使用过程中，当环境条件适合于低产型突变株繁殖时，使其在数量上占优势，便表现出低产水平 3.菌种生理状况的改变菌种生理状况的改变•（1）一个菌种不是一个单一的群体，而是由一些变株混合而成的，这些变株所占的比例决定该菌种的特性•（2）菌种培养基的影响•（3）在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使得菌种的生理状态改变。
二、自然选育的方法二、自然选育的方法 •1. 单孢子悬浮液的制备•定量稀释后制成50～200个单细胞／ml的菌悬液•2. 分离及单菌落培养 • 根据计数结果，按丝状真菌、放线菌菌落大小不同，分离量以5～20个菌落／平皿为宜• 3．筛选• 将分离培养后的各型单菌落，接斜面培养，成熟后接入发酵瓶，测定发酵单位的过程称为筛选它分初筛、复筛两个过程•初筛系指初步筛选，以多量筛选为原则•复筛是对初筛得到的高产菌株的复试，以挑选出稳定高产菌株为原则 •初筛、复筛都要同时以生产菌株作对照复筛选出的高单位菌株至少要比对照菌株产量提高5％以上，并经过菌落纯度、摇瓶单位波动情况，以及糖、氮代谢等的考察，合格后方可在生产罐上试验复筛得到的高单位菌株应制成沙土管、冷冻管或液氮管进行保藏 第二节第二节 诱变育种诱变育种•通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种•诱变育种的特点：具有速度快、收效大、方 • 法简便 ；但是诱发突变缺• 乏定向性、工作量大。
•诱变育种工作主要包括出发菌株的选择、诱变处理和筛选突变株三个部分 一、诱变剂的种类一、诱变剂的种类•1.物理诱变剂•紫外线、快中子、X射线、r-射线、激光•2.化学诱变剂•（1）碱基类似物：5-Bu•（2）与碱基起反应的物质：亚硝酸、氮芥、• 羟胺、硫酸二乙酯、NTG（N-甲基-N-硝基- • N-硝基胍）•（3）丫啶类•3.生物诱变剂：噬菌体 二、突变诱发过程•前突变 ：诱变剂所造成的DNA分子的某一位• 置的结构改变称之•前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发生突变 （一)诱变剂接触DNA分子前•1.细胞对诱变剂的透性将影响诱变效果•2.细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相• 互作用而影响诱变效果•3.与基因所处的状态有关，而基因的状态又• 和培养条件有关 (二)DNA损伤的修复 •微生物有五种方式来修复DNA损伤•1．光复活作用•2．切补修复:• 四种酶的作用：核酸内切酶 、核酸外 • 切酶 、DNA多聚酶 、DNA连接酶•3. 重组修复 ：又称为复制后修复•4．SOS修复系统 •5．DNA多聚酶的校正作用：增变突变型 (三)从前突变到突变•校正差错 ：光复活作用、切补修复和DNA多聚• 酶校正作用 •引起差错 ：重组修复和SOS修复系统 •一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变向突变转变这一过程 。
•诱变前后的处理可影响诱变的效果 ：•1.通过影响与DNA修复作用有关的酶的活性而影响诱• 变的效果；•2.通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状• 态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基• 因的突变率 (四)从突变到突变型•表型迟延 ：突变基因的出现并不等于突变表型的出 • 现，表型的改变落后于基因型改变的现 • 象•1．分离性迟延• 是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生型基因和突变型基因并存于同一细胞中)，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因)时，其性状才得以表达•2．生理性迟延• 突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来 三、诱变育种方案的设计•诱变育种包括三个环节：突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现• (一)制定筛选目标 • (二)制定筛选方案 • 1．诱变过程• (1) 出发菌种的斜面 • (2) 单孢子悬浮液制备 • (3) 孢子计数 • (4) 单菌落分离 2．筛选过程 •(1) 传种斜面 •(2) 留种保藏菌种 •(3) 筛选高产菌株• 四、突变的诱发•突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。
•1.出发出株的选择•（1）选择纯种 •选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株 •（2）选择具有优良性状的出发菌株 •选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性 •（3）对诱变剂敏感 •可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大•（4）选择多个出发菌株 2.诱变剂的选择•（1）根据出发菌株的遗传背景•（2）菌株遗传性质的稳定程度•（3）诱变剂本身的特点•（4）诱变剂的剂量 3.影响诱变效果的因素 （1）菌种的遗传稳定性以及对诱变剂的敏感性（2）菌种的生理状态（3）菌种的预处理和后处理条件（4）其他外界条件 五、突变株的筛选•(一)随机筛选 •1．摇瓶筛选法 •2．琼脂块筛选法•3．筛选自动化和筛选工具微型化 (二) 理性化筛选 指运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株的筛选方法 1．初级代谢产物高产菌株的筛选 • (1)降低终产物浓度：•①筛选终产物营养缺陷型 •②筛选细胞膜透性改变的突变株 • (2)筛选抗反馈调节突变菌株 •①筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株 •抗反馈抑制 、抗反馈阻遏 •②利用回复突变筛选抗反馈突变菌株 2．次级代谢产物(主要是抗生素)高产 菌株的筛选•(1) 利用营养缺陷型筛选 •渗漏缺陷型是遗传性障碍不完全的营养缺陷型，突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。
•(2)筛选负变株或零变株的回复突变株 •(3) 筛选去磷酸盐调节突变株 •(4) 筛选去碳源分解代谢调节突变株•(5) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 •(6)筛选二价金属离子抗性突变株 •(7)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株•(8) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株•3.营养缺陷型筛选 •（1）营养缺陷型的富集• 抗生素富集法、过滤法•（2）营养缺陷型的检出• 点种法、夹层琼脂法•（3）营养缺陷型的鉴定• 点种法、生长谱法•六、突变高产基因的表现 七、诱变育种工作前的准备工作•1.菌种培养特性的摸索•2.最佳培养条件的摸索•3.产单位高峰时间•4.菌种保藏条件的建立•5.菌种的遗传背景 第三节 杂交育种•杂交育种 是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株•杂交育种的目的在于：•（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株(重组体)；•（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；•（3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种；•（4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。
霉菌的杂交育种•准性生殖(Parasexual reproduction)是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程• ① 选择直接亲本 • ② 异核体的形成 • ③ 杂合双倍体的形成 • ④ 体细胞重组 •染色体交换 、染色体单倍化 第四节 原生质体技术•一、原生质体制备•1．菌体的预处理 •2．菌体的培养时间 •3．酶浓度 •4．酶解温度 •5．酶解时间 •6．渗透压稳定剂 •二、原生质体的融合 •三、融合子的选择•四、原生质体的再生•五、原生质体的诱变•六、原生质体再生与常规诱变相结合 •七、灭活原生质体融合技术在育种中的应用•1.单一亲株灭活 •2．双亲株或多亲株灭活 。