首先我们得来说说染料法SYBRGreen的原理，SYBRGreen能够结合在双链游离的SYBRGreen不发光DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA才会发荧光而游离的不会发土图1SYBRGreen原理但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链DNA，就会染上，并发荧光如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度，因此会产生严重偏差融解曲线我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢？这就需要用到融解曲线在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间(1s或者少于1s)测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBRGreen都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线：荧光强度(R)70jI温度(T)8cd90图2融解曲线然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出荧光强度变化值(dR/dT)7080；解链50%时的温度丁温度仃）90图3融解曲线的求导为什么中间的峰那么高？dR/dT越大，表明荧光值变化最快随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开,荧光值下降非常快。
如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰（温度和qPCR产物长度以及GC含量相关）但是除了单峰还会出现什么样的情况呢？请看下面两个示意图荧光强度变化值(dR/dT)杂虑岀现在主峰前.且温度一股低于80度”多半杲引物二聚体”也可能是非特异性扩增岀片段小于目的片段的产物A7080—厂温度(T)90图4前置杂峰708090荧光强度变化值(dR/dT)温度(T)亲岸岀SE在主峰后「扩览出了片段大于目的产物的非特异性片段Arb图5后置杂峰。