PCR-ELISA 端粒酶检测法 发布日期:2007-6-27 热门指数:782 收藏 端粒是真核生物染色体末端的特异 DNA-蛋白结构，端粒 DNA 是一系列重复的富含 G 的 DNA 序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为 TTAGGG） 已确认端 粒在保护基因组 DNA 不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染 色体移位和染色体缺失）中起重要作用由于 DNA 聚合酶不能复制线性 DNA 的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个 复制循环就进行性缩短这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的 正常体细胞有限的繁殖能力有关这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用与体细胞相对照，生殖细胞是永生 性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息因此它必须对抗端粒缩短这一工作 通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的 RNA 成份的互补序列作模板，催化 TTAGGG 重复序列加到染色体末端在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶 活性的表达端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性由于需要大量的样品材 料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol, TRAP）所取代标准的 TRAP 测定是通过 PCR 扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳 后，通过放射自显影显示结果这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法这 种方法具有如下特点：安全，无需使用放射性同位素一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和 PCR 扩增可在一个试管中进 行应用广泛，扩增后可适用于不同分析法灵敏，与放射性同位素 TRAP 测定相当可靠，准确、重复性好快速，6-8 小时得到结果现介绍如下：1.原理： 本法是建立在 Kim 等人描述的 TRAP 方法的基础上的，它将端粒酶介导的衍生产物进行 PCR 扩增, 并与后序的 ELISA 法结合在一起 本法可分如下几步： （1）延伸/扩增： 第一步：端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）加到带有生物素标记的 P1-TA 引物的 3’末端第二步：利用引物 P1-TS 和 T2 通过 PCR 扩增这些延伸出的产物，产生出的 PCR 产物 带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。
2）ELISA 测定： PCR 产物变性后与 Dig 标记的端粒特异的重复检测探针杂交终产物可经生物素标记的探 针固定到亲和素包被的微量滴定板上固定的 PCR 产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛 复合物（anti-Dig-POD）检出最后，经过分解底物 TMB 形成一种有色的反应物，再用酶 标仪进行检测2.应用：本法可用于从培养细胞和其他生物样品的抽提物进行端粒酶活性的高敏感性检测3.检测步骤：3.1 样品制备：3.1.1 细胞提取物的制备：—按标准方法采集并进行细胞记数（trygan 染色，使用血细胞计数器 ）—每个反应取 2*105 细胞移入一个新的试管—2-8℃下以 3000g 离心 10 分钟形成细胞团—小心移去上清液，将细胞在 PBS 中重悬并重复离心步骤—小心移去上清液，细胞小团可放在-80℃下储存—若准备细胞提取物，将细胞小团在 200ul 裂解试剂中重悬，冰上预冷并提吸至少 3 次，冰中孵育 30 分钟如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团—2-8℃，16000g 离心裂解物 20 分钟—小心移去上清液并移入新的离心管中保证将细胞残渣带入，我们推荐仅抽吸 175ul 细胞提取物。
—继续进行 TRAP 反应—如不立即进行 TRAP 反应，将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻，将提取物储存 在-80℃3.1.2 组织中提取物的制备：—测定端粒酶活性的组织标本准备，需要小心的采样并保存临床材料，因为肿瘤细胞 的污染可产生正常组织中的假阳性信号，而由于不恰当的保存也可在肿瘤样本中产生阴性 信号如不是立即用于端粒酶 PCR ELISA 组织样本应以小片在液氮中休克性冷冻，并保存 在-80℃—冰上孵育 30 分钟—2-8℃，16000g 离心细胞裂解液 20 分钟可用冷冻台式离心机及离心管—小心将上清液移入新的离心管中，确保无组织残片被带入，我们建议仅抽提 175ul 组织提取物，以标准方法测定蛋白浓度，在液氮中休克性冷冻小份组织提取物，将提取物 存放在-80℃3.2 端粒酶重复序列扩增步骤（TRAP 反应） —对于每一待例检测样本，先将 25ul 反应复合物加入适合 PCR 扩增的管中，加入 1- 3ul 细胞提取物（相当于 1*103-3*103 细胞或 1-50ug 总蛋白） 并加入无菌水至总体积 50ul，所有吸取步骤在冰上进行—将离心管置于 PCR 仪中，照下列步骤进行引物延伸/扩增反应。
3.3 杂交及 ELISA 反应流程：—每个样品取 20ul 变性试剂加入适宜的离心管中，若有大量样本，建议使用无核酸酶 包被的微孔板 MTP—加入 5ul 扩增产物，15-25℃孵育 10 分钟—每个离心管内加入 225ul 杂交缓冲液，用振荡器完全混匀 （如需要，杂交混合物量可以用于二次检测扩增产物 ）—取出 100ul 混合物加入试剂盒中已包被的微孔板的每个孔中，并用盖子盖住小孔以 防蒸发—将 MTP 微孔板置于 37℃，300rpm 的振荡器中孵育 2 小时—弃去全部杂交液，以清洗缓冲液洗三次，每孔 250ul 每次至少 30 秒，小心弃去冲洗 液—每孔加入 100ul 抗-DIG-POD 工作液，用盖子盖上 MTP，15-25℃（18-22℃）置于 300rpm 的摇床上孵育 30 分钟—完全弃去溶液，以每孔 250ul 清洗缓冲液冲洗 5 次，每次至少 30 秒，小心弃去冲洗 缓冲液—每孔加入 100ulTMB 底物溶液预热至室温，盖上盖子，在 300rmp 的摇床上孵育 10- 20 分钟——不要移去反应底物，每孔加入 100ul 终止试剂以终止反应注意：加入终止液后等已反应的 POD 底物的颜色从蓝转黄，这是取得最高敏感度所必 要的。
——使用 ELISA 酶标仪，测定加入终止液后 30 分钟内标本 450nm 吸收值（参照波长 为 690nm） 4.结果分析： 吸光值为 A450nm，参照空白对照读数（A690nm） 4.1 阴性对照： 将细胞提取物与无 DNA 酶的 RNA 酶预孵育，降解端粒酶内源性 RNA 作为检测端粒酶的 阴性对照，另一种方法为热处理以取得阴性对照用 RNA 酶处理标本，阴性对照最大的 吸收值为 0.25A450nm-690nm，如果数值较高，整个实验包括 TRAP 反应需重新进行4.2 阳性对照： 阳性对照的吸收值在底物反应 20 分钟后检测，应高于 1.5（A450nm-A690nm） ，相当于使 用 1*103 细胞进行检测如果数值较低，整个实验包括 TRAP 反应需重新进行4.3 样本： 将样本的吸收值减去阴性对照的值如果吸收值的差异（ΔA）高于 0.2（A450nm- A690nm）可认为端粒酶阳性5.常见问题分析及解决方案1 阳性对照信号过低或无 Ø 所用热循环仪的型号不适合所设的热循环程序，选择适宜的循环条件 Ø 引物延长、扩增所用的水含有核酸酶必须使用无核酸酶的重蒸水（DEPC 或 Velcorin 处理）来制备试剂。
Ø 试剂受核酸酶污染另换阳性对照细胞提取物及样本重复全部检测仔细检查是否污染 了 DNA 酶及 RNA 酶 Ø 孵育步骤未在 300rmp 振荡器下进行选用合适的振荡器 Ø 抗 DIG-POD 工作液失效，必须使用新准备的抗 DIG-POD 工作液，检查抗 DIG-POD 工作液的酶活性是否失效并准备新鲜的工作液 2 阴性对照信号过高 Ø 阴性对照、裂解试剂、或反应混合物被端粒酶阳性细胞提取物污染，以 RNA 酶处理或 65℃热处理 10 分钟是阴性对照失活重复包括扩增在内的整个实验 Ø 阴性对照、裂解试剂、反应复合物、或其它试剂可能被以前实验的扩增产物所污染 Ø 在检测步骤中，冲洗不充分，增加冲洗步骤 Ø 与 TMB 底物溶液的孵育过长，加入 TMB 底物溶液 20 分钟内停止底物反应。