单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血清,碱性磷酸酶,活性测定,磷酸苯二钠法,ALP,姓名：刘慧,班级：,20104289,学号：,2010415125,主要内容,实验目的,实验原理,实验器材与试剂,实验操作,计算,临床意义,注意事项,思考,实验目的,掌握酶活力测定的一般方法,掌握血清中ALP活力测定方法,掌握血清中ALP测定的临床意义,思考,？,如何测定酶活力的大小,？,酶活力,：,酶催化某一化学反应的能力，其衡量的标准是,酶促反应速度的大小酶促反应的速度：,常用,单位时间内底物的减少量或产物的生成量,来表示,反应速度 活力,酶活力测定方法,终止测定法（或定时法）：,*本次实验的方法,通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。
连续监测法：,连续监测法是指每隔一定时间（260s），连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法适用于自动生化分析仪,目前已取代固定时间法而成为临床实验室测,什么是ALP？,碱性磷酸酶ALP是一组在,碱性环境,中,水解磷酸酯,的酶类来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多正常人血清中ALP主要来源于,肝脏,是一种能够将对应底物,去磷酸化,的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的,磷酸基团,除去，并生成,磷酸根离子,和,自由的羟基,，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力实验原理,测定ALP的方法主要分为两种,一是测定底物解离下的,磷酸根,来计算酶活力,，,如-甘油磷酸钠法，但存在血清本身有磷酸根的缺点；,二是测定底物解离磷酸根后的,羟基化合物,，这种方法又可分为：,酚化合物在显色剂的作用下显色比色测定生成的酚化合物本身在一定的条件下就可显色，如对硝基苯磷酸二钠（PNPP）法,在PH=10的环境中，,ALP,催化,磷酸苯二钠,水解,苯酚,和,磷酸氢二钠,苯酚,与,4-氨基安替比林,色素原,该色素原经,铁氰化钾,氧化生成红色,醌亚胺衍生物,测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。
磷酸苯二钠+H,2,O,(ALP,PH=10),苯酚+磷酸氢二钠,苯酚+4-氨基安替比林,（铁氰化钾）,醌亚胺衍生物,试剂与仪器,（一）,0.1mol/L碳酸盐缓冲液,（含4-氨基安替比林）,4-氨基安替比林：,淡黄色结晶熔点109溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚,4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入铁氰化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量,（二）,20mmol/L磷酸苯二钠溶液,（三）,铁氰化钾的硼酸溶液,（四）,酚标准工作液,器材：,5ml移液管、1ml移液管、加样枪、分光光度计、1cm比色皿,37C水浴锅,实验操作,取4支试管，如下操作：,立即混匀用510nm波长（红色醌物质的最大吸收波长）比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度保持反应时温度是均衡的，37C,计算公式,ALP活性金氏单位定义:,每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚1mg为1金氏单位ALP活性=(At-Ac)/(As-Ab)*0.05*100(金氏单位),参考值,成人：313金氏单位；儿童：528金氏单位注意事项,酚标准液开后不能久置底物液不能含有酚，若含酚则显,红色,，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。
加入铁氰化钾后必须,迅速混匀,(为了改变PH来终止酶促反应），否则有影响，偏大铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用此液应避光保存，如出现,蓝绿色,即作废,临床意义,在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标1.,血清ALP活性升高 肝胆疾病,：,阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等,2.,血清ALP活性降低,:,比较少见，主要见于呆小病，ALP过少症，维生素C缺乏症思考题,1.本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？,答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH，使其不再处于最适PHB,管与,C,管在实验中有何作用,?,不设两管有何影响？,答：做参比溶液3.,实验过程两次水浴保温，一次,5min,，一次,15min,意义相同吗？有何区别？,答：不同前者是达到最适温度，后者是反应时间4.,用标准曲线如何设计本实验操作过程？,标准曲线法,取试管按表操作,加入物（ml),0,1,2,3,4,5,酚标准应用液,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,蒸馏水,1.1,0.9,0.7,0.5,0.3,0.1,碳酸盐缓冲液,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,铁氰化钾溶液,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,3.0,相当于金氏单位,0,10,20,30,40,50,立即混匀，选择波长510nm，用零号管调零，读取各管吸光度，并与相应酶金氏单位对应，绘制校正曲线,。
其他方法：,磷酸对硝基酚连续监测法,在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对,硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测,定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中,ALP活性成正比反应需要Mg2+作为激活剂实验小结,磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速磷酸苯二钠比色法水解速度快，故保温时间较短该法灵敏度较高，显色稳定，不需去蛋白，操作简单、快速但与磷酸对硝基酚连续监测法相比，准确度、精密度较低，操作比较繁琐，灵敏度低；酶单位不是国际单位；受胆红素和溶血的干扰但是若用磷酸对硝基酚法测定，在反应过程中会生成有毒的对硝基苯,酚，对皮肤和黏膜有很大的伤害Thank you,END,。