病理学常用技术的原病理学常用技术的原理及运用理及运用 第一节第一节 大体与组织病理学技术大体与组织病理学技术 大体察看大体察看——主要运用肉眼或辅以放大镜、主要运用肉眼或辅以放大镜、量尺和磅秤等工具，对大体标本及其病变性状进量尺和磅秤等工具，对大体标本及其病变性状进展细致的察看和检测展细致的察看和检测 组织和细胞学察看组织和细胞学察看— 将病变组织制成切片染色，将病变组织制成切片染色，或零落、穿刺细胞涂片染色，显微镜察看或零落、穿刺细胞涂片染色，显微镜察看 第二节第二节 组织化学与免疫组织化学组织化学与免疫组织化学 〔一〕〔一〕 组织化学组织化学 普通称特殊染色，经过运用某些组织化学成分普通称特殊染色，经过运用某些组织化学成分特异性结合的显色试剂，显示病变组织细胞的化学特异性结合的显色试剂，显示病变组织细胞的化学成分成分(如蛋白质、酶类、核酸、糖类、脂类等〕，如蛋白质、酶类、核酸、糖类、脂类等〕，从而加深对形状构造和代谢改动的认识，弄清形状从而加深对形状构造和代谢改动的认识，弄清形状改动与代谢改动的关系如过碘酸改动与代谢改动的关系。
如过碘酸Schiff反响〔反响〔PAS〕或区别骨〕或区别骨Ewing肉瘤和淋巴瘤，前者胞浆内肉瘤和淋巴瘤，前者胞浆内含有糖原呈阳性，后者阴性，磷钨酸苏木精染色可含有糖原呈阳性，后者阴性，磷钨酸苏木精染色可显示横纹肌肉瘤中瘤细胞胞浆中的横纹显示横纹肌肉瘤中瘤细胞胞浆中的横纹 〔二〕免疫组织化学〔二〕免疫组织化学 是利用抗原抗体的特异性结是利用抗原抗体的特异性结合反响来检测和定位组织或细胞中合反响来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，有较的某种化学物质的一种技术，有较高的敏感性和特异性，能将形状学高的敏感性和特异性，能将形状学改动与功能、代谢变化结合起来，改动与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片、培育直接在组织切片、细胞涂片、培育细胞爬片上定位某些蛋白质或多肽细胞爬片上定位某些蛋白质或多肽类物质，结合计算机图像分析技术类物质，结合计算机图像分析技术或激光扫描共聚显微术等，对被检或激光扫描共聚显微术等，对被检物质进展定量分析物质进展定量分析 1 1、免疫组织化学染色方法、免疫组织化学染色方法 按标志物性质分：荧光法、按标志物性质分：荧光法、酶法、免疫金、银及铁标志技术等。
酶法、免疫金、银及铁标志技术等 按染色步骤分：直接法、间按染色步骤分：直接法、间接法 按结合方式分：抗原按结合方式分：抗原- -抗体抗体结合法、亲和衔接法、标志的链亲结合法、亲和衔接法、标志的链亲和素和素- -生物素法等生物素法等 2 2、免疫组化染色的质量控制和结果、免疫组化染色的质量控制和结果 阳性表达方式：阳性表达方式：〔〔1 1〕胞浆阳性〕胞浆阳性〔〔2 2〕核周胞浆阳性〕核周胞浆阳性〔〔3 3〕胞浆局限性点状阳性〕胞浆局限性点状阳性〔〔4 4〕细胞膜阳性〕细胞膜阳性〔〔5 5〕细胞核阳性〕细胞核阳性 肌动蛋白肌动蛋白 雄激素受体雄激素受体 CD3-T细胞细胞 雌激素受体〔雌激素受体〔ER〕〕 影响免疫组化染色质量的要素：影响免疫组化染色质量的要素： 取材及固定取材及固定 抗体质量抗体质量 抗原封锁和修复抗原封锁和修复 技术操作技术操作 3 3、免疫组化的运用、免疫组化的运用 大量商品化的单克隆和多克隆抗体大量商品化的单克隆和多克隆抗体出现、配套试剂盒的运用及方法学的不断完出现、配套试剂盒的运用及方法学的不断完善，使免疫组织化学染色曾经成为医学根底善，使免疫组织化学染色曾经成为医学根底研讨和病理外检中运用最为广泛的技术手段研讨和病理外检中运用最为广泛的技术手段之一。
之一 免疫组化技术可用于各种蛋白质或免疫组化技术可用于各种蛋白质或肽类物质表达程度的检测、细胞属性的断定、肽类物质表达程度的检测、细胞属性的断定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研讨，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，的研讨，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研讨等以及细胞周期和信号转导的研讨等 免疫组织化学染色技术也是非放免疫组织化学染色技术也是非放射性原位杂交、原位射性原位杂交、原位PCRPCR和原位末端标志和原位末端标志DNADNA片段等技术的根底片段等技术的根底 第三节第三节 电子显微镜技术电子显微镜技术 透射电子显微镜是最早、最广泛运用于医学领域的一种电镜，以后又相继诞生了扫描电镜、超高压电镜等电镜的运用大大地开阔了我们的视野，看清了细胞膜和细胞浆内的各种细胞器和细胞核的细微构造及其病理变化，并由此产生了亚细胞构造病理学，又称超微构造病理学 电镜技术的运用 在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的研讨和察看；在临床上可用于多种疾病亚细胞构造病变的察看和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断，以及一些疑问肿瘤的组织来源和细胞属性断定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细胞凋亡的形状学描画也是源于电镜的察看。
随着电镜技术的不断开展，以及与其他方法的综合运用，还出现了免疫电镜、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微术等 电镜技术也有其局限性，如电镜设备昂贵、样本制备较复杂、实验费用较高；另外，由于样本取材少，察看范围有限，有时还能够会脱漏信息；当用于辅助肿瘤外检诊断时，只能断定组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性 第四节原位多聚酶链式反响技术第四节原位多聚酶链式反响技术 原位多聚酶链式反响技术是多聚酶链式反响(polymerase chain reaction，PCR)技术的一部分，是在体外经酶促反响将某一特定DNA序列进展高效、快速扩增，它可将单一拷贝或低拷贝的待测核酸以指数的方式扩增而到达常规方法可检测的程度原位PCR(in situ PCR)技术是将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞及组织学定位相结合，在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片或培育细胞爬片上来检测和定位核酸的技术 原位原位PCRPCR技术方法技术方法 原原位位PCRPCR技技术术有有直直接接法法原原位位PCRPCR、、间间接接法法原原位位PCRPCR、、原原位位反反转转录录PCRPCR和和原原位位再再生生式式序序列列复复制制反反响响等等方方法法，，其其中中运运用用相相对对较较广广泛泛的的是是间间接原位接原位PCRPCR方法。
方法 主主要要程程序序有有组组织织固固定定、、预预处处置置( (如如蛋蛋白白酶酶K K和和RNARNA酶酶消消化化) )、、原原位位扩扩增增及及扩扩增增产产物物的的原原位位杂杂交交和和检检测测等等由由于于运运用用原原位位杂杂交交技技术术对对扩扩增增产产物物作作检检测测，，使使该该方方法法的的特特异异性性较直接法高较直接法高 原位原位PCRPCR技术的运用及存在的问题技术的运用及存在的问题 运运用用：：原原位位PCRPCR技技术术能能用用于于低低拷拷贝贝的的内内源源性性基基因因的的检检测测和和定定位位，，可可用用于于基基因因突突变变、、基基因因重重排排和和染染色色体体易易位位等等的的研研讨讨和和察察看看；；还还可可用用于于外外源源性性基基因因的的检检测测和和定定位位，，如如对对各各种种感感染染性性疾疾病病病病原原的的基基因因检检测测，，如如EBEB病病毒毒、、人人乳乳头头状状瘤瘤病病毒毒、、肝肝炎炎病病毒毒、、巨巨细细胞胞病病毒毒和和人人免免疫疫缺缺陷陷病病毒毒基基因因组组及及结结核核、、麻麻风风杆杆菌菌基基因因的的检检测测等等；；在在临临床床上上还还可可用用于于对对接接受受了了基基因因治治疗疗患患者者体体内内导导人人基基因因的的检检测等。
测等 存在的问题：存在的问题： ①①特特异异性性不不高高，，特特别别是是假假阳阳性性的的问问题题产产生生的的缘缘由由有有引引物物与与模模板板的的错错配配、、在在扩扩增增中中因因细细胞胞内内受受损损伤伤DNADNA的的修修复复而而构构成成的的非非特特异异性序列和特异性扩增序列的弥散等性序列和特异性扩增序列的弥散等 ② ②技术操作复杂，影响要素太多技术操作复杂，影响要素太多 ③③需需求求特特殊殊的的设设备备，，即即原原位位PCRPCR仪仪，，价价钱昂贵 第五节核酸原位杂交第五节核酸原位杂交 原位杂交是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结合来检测和定位核酸的技术用标志了的知序列的核苷酸片段作为探针，经过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培育细胞爬片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在其生物化学根底是DNA变性、复性和碱基互补配对结合根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交 探针的选择和标志探针的选择和标志 用用于于原原位位杂杂交交的的探探针针有有双双链链cDNA探探针针、、单单链链cDNA探探针针、、单单链链cRNA探探针针和和合合成成的的寡寡核苷酸探针等。
核苷酸探针等 探探针针的的长长度度以以50-300个个碱碱基基为为宜宜，，用用于于染染色色体体原原位位杂杂交交的的探探针针可可为为1.2～～1.5kb探探针针标标志志物物有有放放射射性性同同位位素素如如3H、、35S、、32p等等，，这这类类探探针针的的敏敏感感性性高高；；非非放放射射性性探探针针标标志志物物有有荧荧光光素素、、地地高高辛辛和和生生物物素素等等，，其其敏敏感感性性不不如如放放射射性性标标志志探探针针，，但但有有性性能能稳稳定定、、操操作作简简便、本钱低和耗时短等优点便、本钱低和耗时短等优点 原位杂交的主要程序原位杂交的主要程序 实实验验资资料料：：常常规规石石蜡蜡包包埋埋组组织织切切片片、、冰冰冻冻组组织织切切片片、、细细胞胞涂涂片片和和培培育育细细胞胞爬爬片等 主主要要程程序序：：包包括括杂杂交交前前预预备备、、预预处处置置、、杂杂交交、、杂杂交交后后处处置置-清清洗洗和和杂杂交交体体的的检测等 应应留留意意的的问问题题：：①①DNA-RNA杂杂交交和和RNA-RNA杂杂交交，，需需灭灭活活RNA酶酶处处置置；；运运用用双双链链cDNA探探针针和和/或或待待测测靶靶序序列列是是DNA时时，，需需进进展展变变性性处处置置使使DNA解解链链；；②②杂杂交交温温度度应应低低于于杂杂交交体体的的解解链链温温度度(Tm)25度度左左右右；；③③对对照照实实验验：：有有组组织织对对照照、、探探针针对对照照、、杂杂交交反反响响体体系系对对照照和和检检测系统的对照等，根据详细情况选用。
测系统的对照等，根据详细情况选用 荧光原位杂交 可以用直接法或间接法进展，直接法以荧光素直接标志知DNA探针，间接法以非荧光标志物标志知DNA探针，再桥连一个荧光标志的抗体 本法是一种DNA-DNA杂交，实验资料可以是间期细胞、分裂中期的染色体，也可以是冰冻或石蜡切片等探针有不同的类型，如反复序列探针、位点特异性探针和全染色体探针等，目前已有大量商品化的荧光标志探针 原位杂交技术的运用原位杂交技术的运用 原原位位杂杂交交可可运运用用于于：：①①细细胞胞特特异异性性mRNAmRNA转转录录的的定定位位可可用用于于基基因因图图谱谱、、基基因因表表达达和和基基因因组组进进化化的的研研讨讨；；②②感感染染组组织织中中病病毒毒DNADNA／／RNARNA的的检检测测和和定定位位；；③③癌癌基基因因、、抑抑癌癌基基因因及及各各种种功功能能基基因因在在转转录录程程度度的的表表达达及及其其变变化化的的检检测测；；④④基基因因在在染染色色体体上上的的定定位位；；⑤⑤检检测测染染色色体体的的变变化化，，如如染染色色体体数数量量异异常常和和染染色色体体易易位位等等；；⑥⑥分分裂裂间间期期细细胞胞遗遗传传学学的的研研讨讨，，如如遗遗传传病病的的产产前前诊诊断断和和某某些些遗遗传传病病基基因因携携带带者者确确实定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。
实定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等 第六节第六节 显微切割术显微切割术 显微切割术是90年代初开展起来的一门新技术，可以从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进展有关的分子生物学方面的研讨，如PCR，PCR-SSCP及比较基因组杂交等 资料：冰冻或石蜡包埋组织切片或细胞涂片切片的厚度为4-10um，冰冻切片需经甲醛或乙醇固定用于显微切割的组织切片必需染色，以便于进展目的细胞群或单一细胞的定位操作方法：有手工操作法和激光显微切割法激光捕获显微切割技术的根本原理是：将组织切片放在倒置显微镜的载物台上，激光束从切片的上方垂直照射下来，落在要切割的区域该区的乙烯乙酸乙烯酯膜受激光照射后，瞬间温度升高并与其下方的细胞相粘连；当将膜揭起来时，与之相连的细胞也随之被完好地从切片上切割下来；将带有细胞的膜放入试管内经蛋白酶消化使细胞与膜分开，同时也将细胞裂解，获得待提物质，如DNA、RNA或蛋白质等 意义：可从构成复杂的组织中获得某一特定的同类细胞或单个细胞，适用于肿瘤的分子生物学研讨，如肿瘤的克隆性分析、肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改动的比较研讨和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。
缺乏之处是技术难度大；需特殊的设备，激光器造价高 第七节 生物芯片技术 (一)基因芯片 基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度地陈列在如硅片、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片一套完好的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处置系统等 基因芯片的分类和任务原理基因芯片的分类和任务原理 按按基基因因芯芯片片的的功功能能分分：：表表达达谱谱基基因因芯芯片片、、诊诊断断芯芯片片和和检检测测芯芯片片，，前前者者主主要要用用于于基基因因功功能能的的研研讨讨；；后后两两者者可可用用于于遗遗传传病病、、代代谢谢病病和和某某些些肿肿瘤瘤的的诊诊断断或或病病原原微微生物的检测等生物的检测等 表表达达谱谱基基因因芯芯片片检检测测的的根根本本原原理理：：用用不不同同的的荧荧光光染染料料经经过过逆逆转转录录反反响响将将不不同同组组织织的的mRNAmRNA分分别别标标志志制制成成探探针针，，将将探探针针混混合合后后与与芯芯片片上上的的DNADNA片片段段进进展展杂杂交交、、洗洗涤涤，，用用特特有有的的荧荧光光波波长长扫扫描描芯芯片片，，得得到到这这些些基基因因在在不不同同组组织织或或细细胞胞中中的的表表达达谱谱图图片片，，再再经经过过计计算算机机分分析析出出这这些些基基因因在在不同组织中表达差别的重要信息。
不同组织中表达差别的重要信息 基因芯片的运用：基因芯片的运用： 根根底底研研讨讨方方面面有有基基因因表表达达谱谱分分析析、、基基因因分分型型、、基基因因突突变变的的检检测测、、新新基基因因的的寻寻觅觅、、遗遗传传作作图图和和重重测测序序等等；；临临床床上上可可用用于于抗抗生生素素和和抗抗肿肿瘤瘤药药物物的的挑挑选选和和疾病的诊断等方面疾病的诊断等方面 利利用用基基因因芯芯片片可可以以大大规规模模、、高高通通量量地地对对成成千千上上万万个个基基因因同同时时进进展展研研讨讨，，从从而而处处理理了了传传统统的的核核酸酸印印迹迹杂杂交交技技术术操操作作复复杂杂、、自自动动化化程程度度低低、、操操作作序序列列数数量量少和检测效率低等问题少和检测效率低等问题 实实验验资资料料是是重重新新颖颖组组织织或或培培育育细细胞胞中中提提取取的的mRNAmRNA，，对对外外周周血血或或培培育育细细胞胞样样本本的的研研讨讨相相对对容容易易，，对对实实体体瘤瘤的的研研讨遭到限制讨遭到限制 蛋白质芯片蛋白质芯片 蛋蛋白白质质芯芯片片是是继继基基因因芯芯片片之之后后开开展展起起来来的的对对基基因因功功能能产产物物表表达达程程度度检检测测的的技技术术。
也也是是在在一一个个载载体体上上点点布布高高密密度度不不同同种种类类的的蛋蛋白白质质，，再再用用荧荧光光标标志志的的知知抗抗体体或或配配体体与与待待测测样样本本中中的的抗抗体体或或配配体体一一同同同同芯芯片片上上蛋蛋白白质质竞竞争争结结合合，，在在扫扫描描仪仪上上读读出出荧荧光光强强弱弱，，再再经经计计算算机机分分析计算出待测样本结果析计算出待测样本结果 检检测测容容量量已已达达一一万万三三千千多多个个点点，，并并实实现现了了整整个个过过程程全全自自动动化化检检测测，，具具有有高高效效率率、、低低本本钱钱的的特特点点，，尤尤其其适适宜宜于于蛋蛋白白表表达达的的大大规规模模、、多多种种类类筛筛查查，，并并能能用用于于受受体体——配配体体、、多多种种感感染染要要素素的的筛筛查和肿瘤的诊断查和肿瘤的诊断 组织芯片组织芯片 组组织织芯芯片片是是将将数数十十个个至至数数百百个个小小的的组组织织片片整整齐齐地地陈陈列列在在某某一一载载体体上上( (通通常常是是载载玻玻片片) )而而成成的的微微缩缩组组织织切切片片。
制制造造流流程程主主要要包包括括组组织织挑挑选选和和定定位位、、阵阵列列蜡蜡块块的的制制造造和和切切片片等步骤 组组织织芯芯片片的的特特点点是是体体积积小小、、信信息息含含量量大大，，并并可可根根据据不不同同的的需需求求进进展展组组合合并并制制成成各各种种组组织织芯芯片片，，能能高高效效、、快快速速和和低低耗耗费费地地进进展展各各种种原原位位组组织织学学的的研研讨讨和和察察看看，，如如形形状状组组织织芯芯片片制制造造流流程程学学、、免免疫疫组组织织化化学学、、原原位位杂杂交交和和原原位位PCRPCR等等在在科科研研任任务务中中可可单单独独或或与与基基因因芯芯片片配配套套用用于于基基因因及及其其蛋蛋白白表表达达产产物物的的分分析析和和基基因因功功能能的的研研讨讨；；还还可可作作为为组组织织学学和和病理学实习教材、外科病理微缩图谱病理学实习教材、外科病理微缩图谱 祝同窗们获得好成果祝同窗们获得好成果 。