植物检验检疫学课程论文1我与植物检验检疫学——蚕豆染色病毒传入中国及其检验、防治浅析探究 08 生工 1 俞伟祥 0800901110 摘要：蚕豆染色病毒(Broadbean stain virus)简称 BBSV ，是今年来发现的蚕豆病毒，其对 蚕豆的减产可达 70%在 1985 年报道在四川、浙江等地检测发生的 BBSV 是中国农科院 1984 年从国际干旱地区农业研究中心(ICARDA)引进，分发给四川农科院作物所等 10 个科 研单位进行品种试验BBSV 可以通过 SPA— ELISA 法，琼脂双扩散法，电镜观察和免疫 电镜，BBSV 抗血清反应以及最近的蚕豆染色病毒 CPS 基因的 RT—PCR 检测方法等方法检测 现在对于此种病毒主要使用扑灭进行防治关键词：蚕豆染色病毒，检疫病毒，检疫方法Abstract: Broadbean stain virus referred to BBSV, is this year to discover the beans virus,and Its to the reduction of horsebean is 70%.The BBSV was reported in Sichuan,Zhejiang,in 1985,what was detected was imported by Chinese Academy from ICARDA,and then distribute them to Sichuan Academy of Crops et al 10 scientific research units to experiment.BBSV could be tested by methods of SPA— ELISA, AGAR double diffusion method, electron microscope and immune electron microscopy, BBSV anti serum reaction and BBSV CPS gene RT-PCR test method. Extinguish prevention is thought useful to guard against BBSV. Key words：：BBSV, Quarantine virus, Quarantine method1 前言前言蚕豆,学名：Vicia faba Linn. 属豆科，一年生或越年生草本。
又称胡豆、佛豆、胡豆、 川豆、倭豆、罗汉豆为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物蚕豆一般认为起源于西南亚 和北非中国蚕豆相传为西汉张骞自西域引入在我国已有近 2000 的栽培历史蚕豆是富 含蛋白质的重要作物,据联合国粮农组织 1981 年的调查估计,全世界蚕豆的种植面积约 362 万公顷,中国的蚕豆面积约 220 万公顷,占全世界总面积的 60%以上[1]根据气候条件和耕作 制度的特点,我国蚕豆的种植情况概分两大区域,主要是分布在一长江流城及其以南地区，是 我国重要的经济作物 蚕豆染色病毒(Broadbean stain virus)简称 BBSV，系豇豆花叶病毒组成员[2]，病毒粒体 直径约 25—28nm1965 年 Lloyd 等首次在英国的蚕豆上发现并描述了这种病毒病株表 现叶片褪绿斑驳和花叶，外种皮呈坏死色避自然条件下侵染蚕豆和小扁豆等豆科植物， BBSV 可通过花粉和种子传播,在小扁豆上种传率可高达 32. 4% ,蚕豆的种传率为 4% ～ 16% , 豌豆的种传率为 20%[2]，其传毒介体有豆长吻象(Apionvorax)和豌豆根瘤象(Sitona lincatus) BBSV 在欧洲、西亚、北非、西非、东非的 22 个国家和地区都有报道[3]，已成为这些国家 和地区蚕豆上的重要病害。
蚕豆苗期或开花期之间感染减产 40- 84％，特别严重者绝产[2] 蚕豆感染该病毒后的典型症状为种子皮呈坏死色斑，严重时在外种皮形成连续坏死带 苗期植株矮化或顶端枯死，病叶呈退色花叶或畸形植物检验检疫学课程论文22 蚕豆花叶病毒传入中国蚕豆花叶病毒传入中国2.12.1 蚕豆花叶病毒第一次在中国检测发生蚕豆花叶病毒第一次在中国检测发生1985 年 3 月南京农业大学方中达[4]等在我国一些蚕豆生产区调查蚕豆病毒病时，在四 川农科院作物所、湖北农科院现代化所以及江苏启东县农科所的蚕试验田中发现一种我国 未见报道的蚕豆病毒病，这是一种由种子带毒的病毒根据病株症状及对病株进行生物检 测、血清学检测和电镜观察结果，确认病原为蚕豆染色病毒(BBSV)所有病株都发生在由 叙利亚国际旱地农业研究中心供种的试验区内,约 10—40%的小区或品系发病,株发病率在 0—18%之间在病株上未发现能传毒的象甲,也无象甲的为害状,病毒病尚未扩散在试验 区以外的农田里未发现有蚕豆染色病毒存在[1] 此病仅发生在国外引进的蚕豆试验区中，所有品种均由中国农科院作物品种资源所 1984 年从国际干旱地区农业研究中心(ICARDA)引进，分发给四川农科院作物所等 10 个科 研单位进行品种试验。
2.22.2 蚕豆花叶病毒再次在中国检测发生蚕豆花叶病毒再次在中国检测发生1990 年作者在对山西蚕豆病毒病的调查时，从叙利亚 1984 年引进的蚕豆种子种植和 试验地中又发现此病在对从叙利亚引进的在山西太原种植的蚕豆资源调查中，发现了呈 BBSV 典型症状的病毒病，试种的 50 个小区盛品系中有 7 个小区（或品系)发病，发病小 区(或品系)发病率约 2.5—5％，病株均系统感染，病叶典型症状为块状褪绿斑驳和花时， 有的严重矮化，花色变暗蚕豆田周围种植的是麦类作物，无豆类作物种擅，以前也从未 种过蚕豆：调查中未发现豆长吻象甲或豌豆根瘤象，也未发现有象甲为害状从其症状和 种传等特性与过去报道的 BBSV 基本相同，经过进一步的检验说明此病仍属叙利亚引进的 蚕豆种子传带[2]3 蚕豆染色病毒蚕豆染色病毒(BBSV)检测方法检测方法3.13.1 SPASPA—— ELISAELISA3.1.1 溶液配制 3.1.1.1 包被缓冲液(0.1M pM9．6 碳酸盐缓冲液)Na2CO3·1OH2 8．58g ； NaHCO3 5．88g；蒸馏水 1000ml 3.1.1.2 洗涤液(0.02M PBST)Na2HPO4·12H2O 5．80g; NaH2PO4·2H2O 0.59g;Toween 一 2D 0.5ml;NaCl 8.5g;蒸馏 水 1000ml 3.1.1.3 稀释液植物检验检疫学课程论文30.02M PBST 100ml;小牛血清 1ml 3.1.1.4 底物缓冲液(随用随配) 柠檬酸 0.47gNaH2PO4·2H2O 1.84g;蒸馏水 1000ml 3.1.1.5 底物溶液 邻苯二胺 4mg;底物缓冲液 10ml;使用前加 30% H2O2 15,μL 3.1.1.6 终止液 2M H4SO43.1.1.7 2.5μg／ml A-蛋白液(随用随配) 市售 A-蛋白纯品，加 lml 蒸馏水， 配成母液分装成 50μL／瓶，存一 20℃。
用时取 50μL 母液，加 20ml 包被缓冲液，即成 2.5 g／ml 蛋白液 3.1.2 检测步骤 反应板(用 2.5μg／ml A-蛋白液包被,每孔 200μ1)→孵育(37℃3 小时，4℃过夜，倒去包被 液) →冲洗(洗涤液诜 3 次，每次 5 分钟，存 4℃备用) →第一次包被抗血清(BBSV 抗血清 l／2000 或 l／4000)孵育→(37℃l 2 小时，吸出，供第二次包被用) →冲洗(同前) →加待测液 (待涮叶片汁液 1／50 或 l／100，种胚液 1／10 或 l／20 →孵育(37℃ 3 小时，倒去液体) → 冲洗(同前) →第二次包被抗血清(同第一次) →孵育(37℃1 小时，倒去包被液) →冲洗(同前) 一加酶标 A→蛋白(市售，浓度见说明书) →孵育(37℃半小时，倒去液体) →冲洗(同前) → 加底物(每孔 160-180μ1) →孵育(30℃半小时,见颜色反应) →加 2M H2SO4．终止反应→测 OD 值(492nm 波长)3.23.2 琼脂双扩散法琼脂双扩散法3.2.1 琼脂板制备 6g 精制琼脂粉，加 500ml 生理盐水(8.5gNaCl 加 1000ml 蒸馏水)，加 5ml 10 NaN3水浴融化，倒板至洁净玻片，厚 1.5—2mm，凝固后置保湿器中备用。
3.2.2 反应孔与反应液排列 反应孔一组 7 孔，中闻 l 孔，外周 6 孔，两两相对抗血清 与其反应抗原相对排列，生对照抗原与待测抗原相邻排列 3.2.3 反应稀释度 以待测原液或其 l／2 为抗原，抗血清用 l/l6 —l/32 3.2.4 反应条件 保湿，水平放置，6—24 小时后观察结果 3.2.5 判断 凡与阳性对照沉淀线融合，为同一病 毒3.33.3 电镜观察和免疫电镜电镜观察和免疫电镜3.3.1 制膜 3.3.1.1Vormvar 液配制：Formvar l 5／95E(M．W．24000-40000)0.25g，加氯仿至 100m1， 存 4℃备用 3.3.1.2 制膜：取洁净载玻片，垂直蘸 Formvar 液， 晾干，以利刀玻片边缘切断将玻片垂 直插入无离子水中，使膜浮于水面，将洗净的干铜阿排于膜上，铜网上铺滤纸将膜与铜 嗣捞起置滤纸上晾干，喷碳后使用 3.3.2 沾取法 植物检验检疫学课程论文4取病织(0.5 X lcm)，在玻片上用利刀切成细丝，加 l 一 2 滴无离子水将铜网有膜一片置液 滴上，0.5 一 2 分钟后取出，冲洗并吸干，以 2 醋酸双氧铀(醋酸双氧铀 l，加重蒸馏水 或无离子水 50ml，置棕色瓶中，存 4℃备用)负染 3-5 分钟，吸干后电镜观察。
3.3.3 免疫电镜 3.3.3.1 诱捕法 铜网用 1D-5抗血清包被 10 分钟，冲洗，沾病汁液 2o 分钟，冲洗，负染， 观察 3.3.3.2 诱捕和修饰 诱捕步骤与上相同，在负染前再以 l0 抗血清包被 l0 分钟，冲洗，负染，观察凡粒体外附有暗色抗体外套者为阳性反应[5][6]3.43.4 BBSVBBSV 抗血清的制备及特异性测定抗血清的制备及特异性测定3.4.1 抗血清的制备 将 BBSV (1990 年山西病样的分离物)繁殖在成胡 10 号蚕豆上， 接种 后 17 天采收， 提纯，456g 病叶+0.5M pH7.5PB900mJ(内含 0.2％巯基乙醇) 过滤液(+5％ 正丁醇+20％氯仿，振动 5 分钟静置 10 分钟,7000rpm15 分钟)取上清液加 8％PEG 加 3％NaC1 搅拌至 PEG 溶化,置 4℃冰箱过夜 800rpm 30 分钟，取沉淀用 0.01MPB pH7.5(内含 0 002MEDTA)悬浮过夜 7000rpm 10 分钟，取上清液超离 30000rpm 3 小时， 取沉淀用 0.01M PB 悬浮过夜 8000rpm 10 分钟取上清液(BBSV 提纯液)， 提纯的病毒制剂浓为 13mg／m1(病毒得率 28.5mg／kg)。
将其稀释成 5mg／ml， 取 2ml 加 2ml 不完全佐剂，采 用皮下多点注射，1 周 1 次，共 4 次第 4 次改为静脉注射，不加佐剂10 天后采血采 用琼脂免疫双扩散法测定抗血清效价为 l／64～l／128 3.4.2 抗血清特异性测定 用琼脂免疫双扩散法测定制备抗血清和 ICARCA 提供的 BBSV 标准抗血清与 BBSV 抗原(病汁液) 产生明显的沉淀线， 且沉淀城完全相融；与蚕豆健汁 维，蚕豆斑驳病毒，烟草环斑病毒，南方菜豆花叶病毒均不产生沉淀线；与南芥菜花叶病 毒产生弱沉淀线，但此沉淀线与 BBSV 的沉淀线交。