1雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内的药动学研究【摘要】 目的 对雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内药动学进行研究方法 对大鼠鼻腔给予雌二醇 随机甲基化 β 环糊精包合物的生理盐水溶液、雌二醇乙醇溶液和 3 种剂量的雌二醇鼻腔喷雾剂，用非隔室模型统计矩法进行了药物动力学研究，并与静脉注射雌二醇相比较计算绝对生物利用度结果 雌二醇鼻腔喷雾剂三剂量给药组，雌二醇包合物生理盐水溶液和雌二醇乙醇溶液剂给药组的 Tmax 分别为 30、25、13 、20 和 5 min，Cmax 分别为72.41、74.72、259.21、20.51 和 60.65 ng·mL-1，MRT 分别为69. 60、146.52 、740. 65、130.55 和 16.68 min3 个剂量组的雌二醇鼻腔喷雾剂的绝对生物利用度分别为 86.87％、65. 83％和48. 99％，雌二醇包合物溶液组和雌二醇乙醇溶液剂组的绝对生物利用度分别为 56.44％和 24. 38％结论 雌二醇鼻腔喷雾剂 0. 16和 0.48 mg·kg-1 剂量组的绝对生物利用度均高于单独鼻腔给予雌二醇环糊精包合物溶液和雌二醇乙醇溶液组 【关键词】 雌二醇 鼻腔喷雾剂 随机甲基化 β 环糊精 药动学雌二醇（Estradiol, E2）是内源性最强的雌激素，临床上用于改善更年期症状，预防骨质疏松症，防治妇女卵巢切除和原发性卵巢功能障碍等。
目前 E2 的补充疗法最常用的方法是口服、经皮及阴道2补充疗法，但是这些方法在使用中都有一定的局限性口服给药存在肝肠的首过效应,所以生物利用度比较低［1,2］ ，经皮给药的病人中 10％～30％会有皮肤刺激的现象［3］ ，阴道用制剂具有子宫放大反应，且患者适应性差［4］ 近年来，鼻腔给药系统因其生物利用度高，使用方便，给药剂量下毒副作用小等特点被广泛应用作为药物的给药形式，尤其是雌激素类药物的鼻腔给药方式还能够防治绝经期所带来的后遗症（骨质疏松症） ，从而提高病人的依从性，更易被患者接受本文的目的是研究自制雌二醇鼻腔喷雾剂的大鼠体内药动学，并与雌二醇乙醇溶液和雌二醇包合物溶液进行对比1 仪器与试药1．1 仪器日立 L 7200 高效液相色谱仪（日本） ；日立 L 7485 型荧光检测器（日本） ；81 2 型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司） 1．2 试药雌二醇 （浙江医药股份有限公司仙居制药厂） ；乌拉坦（中国医药上海化学试剂公司） ；随机甲基化 β 环糊精（randomly 3methylatedβ cyclodextrin,RAMEB, 德国瓦克公司） ；壳聚糖（大连鑫蝶甲壳素有限公司） ；对羟基苯甲酸乙酯（沈阳市东兴试剂厂） ；苯扎氯铵（Sigma 公司） ；甲醇（色谱纯，天津康科德试剂公司） ；其他试剂均为分析纯。
1．3 动物Wistar 雄性大鼠(体质量 220～250 g)，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003 002 2 方法2．1 样品的配制2．1．1 E2 鼻腔喷雾剂的制备 E2 与 RAMEB 以 1∶1 的摩尔比制备包合物，壳聚糖的用量为 1％，苯扎氯铵的用量为0.01％，氯化钠调节等渗，pH 值在 4. 0～6.0 之间2．1．2 E2 RAMEB 包合物溶液的制备 称取适量的E2 RAMEB 包合物溶解于生理盐水中，氯化钠调节等渗，即得2．1．3 E270％乙醇溶液的制备 称取 E2 原料药适量，将其4溶于 70％乙醇中即得2．1．4 E2 注射剂的制备 称取适量的 E2，将其溶解于注射用水配制的 0.01％（质量浓度）RAMEB 溶液中，即得2．2 给药剂量的确定按体表散热量折算，250 g 大鼠的剂量为 60 kg 人用剂量的0.025 倍，再根据鼻腔给药和静脉注射给药的差异性及在测定过程中的准确性，确定雌二醇鼻腔喷雾剂的给药剂量分别为 0.16、0.48和 1. 60 mg·kg-1，E2 RAMEB 包合物生理盐水溶液、雌二醇乙醇溶液剂和静脉注射给药的剂量均为 0. 16 mg·kg-1。
2．3 给药方法及血浆样品的采集2．3．1 鼻腔给药方法及血浆样品的采集 取雄性 SD 大鼠，体质量 200～250 g，腹腔注射 1.2 g·kg-1 的乌拉坦使大鼠麻醉，固定，打开颈部，暴露气管与食管，取一段聚乙烯管插入气管以维持呼吸再在颈总静脉上插管供取血用用微量注射器前接一柔软PE 管插入大鼠鼻孔约 5 mm，缓慢滴入药液给药后立即结扎食管以防药液从鼻腔流失给药后取血时间点为5、10 、20、30、45、60、90、120、150、180 min，每次取血50.4 mL，8 000 r·min-1 离心 15 min，取出上层血浆，－20 ℃冷冻保存2．3．2 静脉给药方法及血浆样品的采集 大鼠麻醉，剪开一侧腹股沟皮肤，暴露浅表股静脉，分离覆盖黏膜层，左手食指按住股静脉近心端，待股静脉充盈后，1 mL 注射器配 4 号针头，以30°角进行静脉穿刺，推注药液无阻力感，表明针头在血管中，继续缓慢推完药液，给药完毕后用干棉球压迫止血眼眶取血给药后取血时间点为 5、10、20、30、45、60、90 min，每次取血 0.4 mL，8 000 r·min-1 离心 15 min，取出上层血浆，－20 ℃冷冻保存。
2．4 RP HPLC 荧光法测定血浆中 E2 的浓度［5，6］2．4．1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil ODS C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm, Zirchrom） ；流动相为乙腈 水（体积比 40∶60） ，流速为 1 mL·min-1；荧光的激发波长为 267 nm，发射波长为 302 nm；检测温度为 30 ℃2．4．2 内标溶液的配制 精密称取对羟基苯甲酸乙酯 50 mg，置 50 μL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得内标储备液用甲醇稀释为 12.5 μg·mL-1 的内标溶液62．5 血浆样品处理和测定方法取全血约 0.5 mL，于 8 000 r·min-1 离心 10 min，精密量取血浆 0.2 μL，置刻度具塞试管中，用微量进样器加内标溶液 5 μL，旋涡振荡 2 min，再加入 5 mL 乙醚，旋涡振荡 5 min，于 3 000 r·min-1 离心 5 min，吸取上层乙醚，40 ℃用氮气吹干，然后加入 200 μL 甲醇溶解，每次进样 50 μL以 E2 和内标峰面积比R＝As／Ai（As 为 E2 峰面积，Ai 为内标峰面积）为定量依据，计算样品中 E2 的含量。
2．6 样品稳定性试验 取大鼠空白血浆 200 μL，配制 E2 低、中、高 3 个浓度 （浓度分别 1.984、99.200 和 496.000 ng·mL-1）的血浆样品，样品经液 液提取处理后，室温（约 20 ℃）下放置 24 h 测定，以考察处理后的 E2 血浆样品在室温下的稳定性每一浓度进行 3 样本分析3 个浓度下血浆样品中 E2 测定均值与加入值之间的相对误差（RE/%）分别为 3.1%，2.1%和 5. 3%，表明血浆样品处理后在室温下至少可稳定存放 24 h同法配制低、中、高 3 个浓度（浓度分别 1.984、99.2007和 496.000 ng·mL-1）的血浆样品，经反复 3 次-20 ℃冷冻，室温溶解后，测定样品浓度，以考察样品在冷冻和冻融条件下的稳定性每一浓度进行 3 样本分析 3 个浓度下血浆样品中 E2 测定均值与加入值之间的相对误差（RE/%）分别-1.9%，-3.3%和 1.6%，表明血浆样品在冷冻 融溶循环 3 次试验中无明显降解2．7 大鼠体内药物浓度 时间曲线 大鼠鼻腔及静脉注射给予 E2 后的平均血药浓度对时间做图得药物浓度 时间曲线；利用统计矩法对血浆药物浓度数据进行分析（Cmax 和 Tmax 采用实测值） 。
2．8 绝对生物利用度将各鼻腔给药组的血药浓度 时间曲线下面积与静脉注射给药组的曲线下面积相比较，按下列公式得各鼻腔给药组 E2 的绝对生物利用度（F） F=AUC0→∞(i.n)/Xi.n.AUC0→∞(i.v.)/Xi.v.×100%3 结果3．1 大鼠体内药物浓度 时间曲线 8各样品大鼠鼻腔及静脉注射给予 E2 后的平均血药浓度 时间曲线见图 1-43．2 绝对生物利用度 计算各鼻腔给药组 E2 绝对生物利用度，结果见表 1图 1 雌二醇鼻腔喷雾剂鼻腔给药后大鼠体内血药浓度 时间关系曲线图（略）Figure 1 Plasma concentration time curves in rats nasally administered with estradiol nasal spray at the doses of 0. 16, 0.48, and 1.60 mg·kg-1图 2 雌二醇环糊精包合物溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度时间关系曲线图（给药剂量：0.16 mg·kg-1） （略）Figure 2 Plasma concentration time curves in rats nasally administered with estradiol RAMEB solution at the dose of 0.16 mg·kg-19图 3 雌二醇乙醇溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度 时间关系曲线图（给药剂量：0.16 mg·kg-1） （略）Figure 3 Plasma concentration time curves in rats nasally administered with estradiol ethanol solution at the dose of 0.16 mg·kg-1图 4 静脉注射雌二醇溶液后大鼠体内血药浓度 时间关系曲线图（给药剂量：0. 16 mg·kg-1） （略）Figure 4 Plasma concentration time curves in rats intra venously injected with estradiol ethanol solution at the dose of 0.16 mg·kg-1表 1 鼻腔给药后各制剂的主要药动学参数（略）Table 1 Pharmacokinetic parameters after nasal administered with different preparations of estradiol由于 E2 鼻腔喷雾剂的体内过程复杂，药时曲线无法按现有的数学模型进行处理，因此，采用梯形法计算 AUC，并经统计矩处理计算 MRT 等药动学参数。
检验结果显示，E2 鼻腔喷雾剂 0.16 10mg·kg-1 剂量组的 Cmax 与 E2 鼻腔喷雾剂 1.60 mg·kg-1 剂量组和 E2 RAMEB 包合物溶液组之间差异有显著性，AUC 与 E2 鼻腔喷雾剂 0.48、1.60 mg·kg-1 剂量组和 E2 乙醇溶液剂组间差异有显著性（P<0.05） 经计算 3 个剂量组的 E2 鼻腔喷雾剂的绝对生物利用度分别为 86.87％、 65.83％和 48.99％， E2 RAMEB 包合物溶液组和 E2 乙醇溶液剂组的绝对生物利用度分别为 56.44％和24.38％E2 鼻腔喷雾剂 0.16 和 0.48 mg·kg-1 剂量组的绝对生物利用度均高于单独鼻腔给予 E2 RAMEB 包合物溶液，从而说明鼻腔给予 E2 鼻腔喷雾剂提高了 E2 鼻腔吸收的生物利用度4 讨论4．1 动物模型的选择选择合适的动物模型对于确定鼻腔给药后药物的有效性非常重要大鼠等哺乳动物的嗅细胞散在分布于整个鼻腔中，与人体嗅黏膜分布于鼻腔顶部不同，并且嗅细胞数量多，嗅黏膜占鼻黏膜总表面积的比例也高于人体，所以大鼠鼻腔给药后的。