亲 和 层 析 Affinity Chromatography （AC）,一、原理,生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力亲和层析亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶抗体： 抗原，病毒，细胞DNA： 互补DNA或RNA，组蛋白，核酸聚合酶， 结合 蛋白激素或药物：受体，载体蛋白细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞,常见具有专一性亲和力的生物分子对：,Some definitions in affinity chromatography,Matrix(基质或载体): an inert gel to which a ligand can be coupledLigand（配基）: a component which interacts specifically with the targetCoupling（偶联）: covalent attachment of the ligand to the matrixBinding（结合）: association between the ligand and the target固相化 (Immobilise),,固相化——将配体以共价键连接于载体上制成亲和吸附剂,载体的排斥效应小孔经凝胶会明显阻止大分子物与配基结合载体的空间障碍载体影响了配基的空间，特别是小分子配基。
需加碳氢链“手臂”，长度需适中二、亲和层析分离过程,1、装柱和平衡2、上样、亲和吸附3、洗脱,,,,,,,无效洗脱,吸附效率不高,有效吸附,,,,,,,,,影响吸附的因素 1、缓冲液离子成份强度、pH、温度等都有影响 2、流速尽可能慢，<10ml/cm2.小时 3、上柱样品用平衡层析柱缓冲液溶解，浓度约20mg蛋白/ml. 4、上样体积取决于亲和力，低则上样量减少，一般柱床体积的5％洗脱方法 （1）非特异性洗脱法：非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来比较经济，较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性 a．当待分离物质与配体亲和力较小时：一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低 b．较强时：梯度洗脱，连续改变缓冲液浓度，使洗脱能力逐渐加强 c、非常强时：强的酸、碱或加入脲、胍等变性剂使蛋白质变性，而从配体上解离出来然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性2）特异性洗脱法：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱： 竞争对配体的结合，这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，待分离物质被取代并洗脱。
例如：用单糖洗脱与凝集素结合的糖蛋白另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱：,已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用 再生步骤：起始缓冲液重复平衡一次用高离子强度和低离子强度溶液处理用弱酸或弱碱溶液处理,4、亲和柱的再生：,三 载体（基质）的选择,1、载体要求： 有丰富的可供活化的化学基团，并在温 和条件下能与配基共价结合 惰性的，非专一性吸附无或足够小 多孔网状结构 良好的机械性能，具有好的液体流动性 有较好的物理和化学稳定性2、常用载体 一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛1）纤维素 优点：来源丰富，可供偶联基团较多，偶联后基团又能突出在载体外缺点：结构不均匀，使偶联上配基浓度不一， 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化,（2）葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺优点： 化学及物理性质稳定，可用强碱除去非特异吸附杂质缺点：孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低。
3）多孔玻璃 优点：不受微生物的侵蚀，机械强度好，化学稳定性好 缺点：但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用4）琼脂糖凝胶 非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用 商品名：Sepharose 型号：2B，4B，6B 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广四 配基的选择,1、配体与待分离的物质有适当的亲和力2、配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素3、配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对配体与待分离物质亲和力没有明显影响4、配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用三、亲和层析的优缺点,1、只需一步纯化步骤，非常简单2、产物非常纯＞95%,,3、可从很稀的溶液中纯化到所需物质4、还可去除已变性或部分降解物质5、但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制6、载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化,四、应用,1、分离和纯化2、分辨化学或遗传学上修饰的酶3、纯化亲和标记的活化中心肽段和蛋白质结构研究4、纯化人工合成的多肽和蛋白质5、解释酶作用机理,Ixv_2 JB 980910,21,Ion Exchange Chromatography,Useful at all stages of purification and at all scales,一、原理,离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的某种离子进行可逆的交换性质来分离离子型混合物的层析方法。
离子交换树脂如何分离蛋白质,洗脱,树脂,,与树脂结合力,,二、离子交换剂的类型,在惰性载体上引入带有电荷的活性基团（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂—— 带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂——带正电荷，与阴离子交换Ø 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定胶体,,胶体,阳离子交换基,强酸性，聚苯乙烯树脂,弱酸性，羧甲基纤维素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂,阴离子交换基,强碱性，聚苯乙烯树脂,弱碱性，二乙氨氨乙基纤维素,离子交换树脂离子交换纤维素离子交换凝胶,（二）按载体种类不同,1.离子交换树脂：聚苯乙烯树脂：,,苯乙烯,二乙烯苯,,母体,交联剂,离子交换树脂的性质,1、一般离子交换剂的特性多孔性：疏松、多孔网状，活性基团在网孔内不溶性：不溶于稀酸、稀碱、有机溶剂稳定性：离子交换性：具相当数量的可交换或带电基团,Dowex 100 149m Dowex 50 297mDowex 20 840m,2、交联度： 合成树脂时所用的交联剂在原料总重量中所占的百分比交联度越大 树脂的网孔越小 膨胀性小 交换量少交联度越小 树脂的网孔越大 膨胀性大 交换量大 膨胀性增加易引起树脂的机械变形破损,,阳离子交换树脂 强酸型 磺酸基 -SO3-H+ 中等酸型 磷酸根 -O-PO2H2 亚磷酸根 -O-POH2 弱酸型 羧基 -COOH阴离子交换树脂 强碱 季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 叔胺、仲胺、伯胺基团,可引入的解离基团,离子交换树脂对离子的亲和力,①阳离子树脂电价数：Na+
为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子据此，强阳性和强阴性离于交换剂应分别选择H型和OH型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型不同基质离子交换剂的选择,1.被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素,1、缓冲液pH的选择 2、缓冲液离子组成的选择3、缓冲液离子强度的选择,,（二）缓冲液的选择,1、缓冲液pH的选择,①要求： 起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来 ②PH值与目标物pI的关系（pH=pI±1） ③选用弱阳离子交换剂时，pH高于其pK； 选用弱阴离子交换剂时，pH低于其pK；,2、缓冲液离子组成的选择,①采用阳离子交换剂应选用阴离子缓冲液， 如：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐②采用阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液， 如：Tris③缓冲液离子不影响被分离物的活性、测定、溶解度3、缓冲液离子强度的选择,①起始缓冲液能使样品中有效成分与离子交换剂结合，一般小于0.1mol/L②洗脱液能使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般0.15mol/L（或采用pH洗脱）。
原则： 所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力 降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱,(三)洗脱剂,四、应用,适用于 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子五、离子交换层析的优点,应用范围广：20种氨基酸中，大部分带正电或负电处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多去除杂质能力强，如对核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及电荷性有差别的蛋白均可去除分离能力强可放在纯化工艺的任何一步Hydrophobic interaction chromatography（HIC）,疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类 是一种通过表面疏水性的差异来分离蛋白质的柱层析方法。