微 生 物 通 报 SEP 20, 2009, 36(9): 1283~1288Microbiology © 2009 by Institute of Microbiology, CAStongbao@研 究 报 告碳 源 对 琥 珀 酸 放 线 杆 菌 发 酵 产 丁 二 酸 的 影响及其代谢流量分析刘宇鹏 1,2 郑 璞 2 倪 晔 2 董晋军 2 孙志浩 2*(1. 河 南 大 生 命 科 院 生 物 工 程 研 究 所 河 南 开 封 475004)(2. 教 育 部 工 业 生 物 技 术 重 点 实 验 室 南 大 生 物 工 程 院 苏 无 锡 214122)摘 要 : 在 厌 氧 条 件 下 , Actinobacillus succinogenes 能 够 利 用 单 糖 、 双 糖 和 糖 醇 等 碳 水 化 合 物 发 酵 生 成 丁 二 酸 , 其 中 以 山 梨 醇 为 碳 源 时 丁 二 酸 的 产 量 最 高 代 谢 流 量 分 析 结 果 表 明 : 与 葡 萄 糖 发 酵 相 比 较 , 由 于 代 谢 系 统 中 积 累 了 更 多 的 NADH, 使 得 代 谢 网 络 关 键 节 点 PYR 和 AcCoA 处 的 代 谢 流 量 分 配 有 了 较 大 的 变 化 , 导 致 更 多 的 碳 源 流 向 丁 二 酸 和 乙 醇 , 而 乙 酸 和 甲 酸 的 分 泌 相 对 减 少 。
关 键词 : 琥 珀 酸 放 线 杆 菌 ,碳 源 ,代 谢 流 量 分 析 (MFA)Effect of Different Carbon Sources on Succinic Acid Production of Actinobacillus succinogenes and Metabolic Flux AnalysisLIU Yu-Peng1,2 ZHENG Pu2 NI Ye2 DONG Jin-Jun2 SUN Zhi-Hao2*(1. Institute of Biotechnology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China)(2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)Abstract: In anaerobic bottles fermentation, glucose, fructose, xylose, lactose, maltose, sucrose and sugar alcohols could be used to produce succinic acid with Actinobacillus succinogenes. When sorbitol was utilized as the carbon source in the batch fermentation, more succinate and ethanol were produced compared with those using glucose, while producing less acetate and formate. The metabolic flux analysis results showed that the flux partitioning at PEP node was stable when glucose was replaced by sorbitol, but the flux partitioning at PYR and AcCoA nodes changed a lot because more reducing power (NADH) was generated to meet the more requirement the synthesis of succinate and ethanol.Keywords: Actinobacillus succinogenes, Carbon sources, Metabolic flux analysis (MFA)丁 二 酸 (Succinic acid)又 称 琥 珀 酸 , 是 一 种 重 要 的 化 工 产 品 , 广 泛 应 用 于 医 药 、 农 药 、 染 料 、 香 料 、油 漆 、 食 品 、 塑 料 和 化 工 业 。
化 合 成 的 丁 二 酸 因 依 赖 石 化 原 料 等 原 因 , 存 在 生 产 成 本 增 高 的 趋 势 ,基金项目：国家 863 计 划 项 目 (No. 2006AA02Z235); 和 创 新 团 队 发 展 计 划 (No. IRT0532); 河 南 省 教 育 厅 自 然 科 基 础 研 究 计 划 项目 (No. 2009B180004); 河 南 大 校 内 基 金 项 目 (No. 2008YBGG042)资 助* 通 讯 作 ： Tel: 86-510-85918252; : sunw@收 稿 日 期 ： 2009-01-06; 接 受 日 期 ： 2009-05-13从 而 使 微 生 物 发 酵 可 再 生 原 料 生 产 丁 二 酸 的 方 法 倍 受 重 视 发 酵 法 生 产 丁 二 酸 是 以 可 再 生 糖 源 (如 葡 萄 糖 )和 二 氧 化 碳 作 为 主 要 原 料 , 不 仅 摆 脱 了 对 石 化 原 料 的 依 赖 , 而 且 开 辟 了 利 用 温 室 气 体 二 氧 化 碳 的 新 途 径 , 使 得 丁 二 酸 发 酵 成 为 一 个 新 兴 的 、 很 有 发 展 潜 力 的 绿 色 工 艺 , 成 为 近 年 来 国 内 外 的 研 究 热 点 [1]。
代 谢 工 程 的 实 质 在 于 对 细 胞 代 谢 流 量 及 其 控 制 进 行 定 量 分 析 , 并 在 此 基 础 上 对 代 谢 过 程 进 行 合 理 调 节 , 以最大限度地提高目的代谢产物的产率 [2]代 谢 流 量 分 析 (Metabolic flux analysis, MFA)是 代 谢 工 程 基 础 研 究 中 最 重 要 的 计 算 代 谢 途 径 中 各 种 物 质 流 量 的 手 段 对 于 工 业 微 生 物 细 胞 而 言 , 在 特 定 的 生白 ) 25 g, Na2HPO4·12H2O 8 g, NaH2PO4·2H2O 3 g,pH 调 至 7.0~7.2, 定 容 至 1 L发 酵 培 养 基 : 葡 萄 糖 (或 其 它 碳 源 ) 20 g, 酵 母 膏 6 g, Na 2HPO4·12H2O 1.5 g, NaH2PO4·2H2O 1.5 g,NaCl 1 g, MgCl2 0.2 g, CaCl2 0.2 g; 另加混合维生素溶 液 3 mL, 其组分为(1 L): 叶酸 20 mg, 硫胺素 20 mg, 烟 酸 20 mg, 硫 辛 酸 20 mg, 核 黄 素 20 mg, VB12 20 mg, VB6 20 mg, 泛 酸 50 mg。
将 培 养 基 定 容 至 1 L, pH 调 6.51.2 方 法1.2.1 培 养 条 件 : 将 培 养 基 装 于 150 mL 厌 氧 瓶 中(装 液 体 积 50 mL), 接 种 量 5%, 充 入 100% CO2,5理 条 件 下 , 其 代 谢 表 型 (Metabolic phenotype)可 以 通 1×10 Pa 灭 菌 15 min; 并 加 膜 滤 过 的 无 菌 过 胞 内 代 谢 网 络 中 各 种 代 谢 物 的 流 量 来 进 行 表 征 MFA 为 更 好 地 设 计 反 应 器 、 调 节 发 酵 培 养 基 组 分 和 优 化 控 制 策 略 打 下 良 好 的 基 础 ; 对 未 知 途 径 而 言 , 可 以 鉴 别 是 否 为 主 要 代 谢 途 径 , 以 及 了 解 副 产 物 的 产 生 途 径 , 以 达 到 提 高 目 的 产 物 积 累 、 去 除 或 减 弱 副 产 物 产 生 途 径 目 的 丁 二 酸 是 许 多 厌 氧 微 生 物 的 代 谢 中 间 产 物 。
自 上 世 纪 90 年 代 美 国 报 道 了 厌 氧 螺 菌 (Anaerobiospirillum succiniciproducens)ATCC 29305[3]和 琥 珀 酸 放 线 杆 菌 (Actinobacillussuccinogenes)ATCC 55618[4]发 酵 生 产 丁 二 酸 技 术 有 所 突 破 以 来 , 丁 二 酸 发 酵 已 经 成 为 了 国 内 外 的 研 究 热 点 , 国 内 生 物 质 原 料 发 酵 法 生 产 丁 二 酸 的 研 究 也 已 经 取 得 了 突 破 性 进 展 , 但 目 前 还 未 见 其 工 业 化 规 模 生 产 的 报 道 本 研 究 室 从 牛 瘤 胃 中 筛 选 获 得 了 一 株 琥 珀 酸 放 线杆菌 Actinobacillus succinogenes CGMCC 1593[5,6], 本 文 主 要 研 究 了 A. succinogenes CGMCC1593 对 各 种 碳 水 化 合 物 的 利 用 情 况 , 并 首 次 分 析 了 碳 源 的 还 原 力 对 Actinobacillus succinogenes 发 酵 代 谢 途 径 中 关 键 节 点 的 代 谢 流 量 分 布 的 影 响 , 为 进 一 步 深 入 了 解 丁 二 酸 发 酵 的 代 谢 调 控 机 制 提 供 理 论 基 础 。
1 材 料 与 方 法1.1 材 料1.1.1 菌 株 : 琥 珀 酸 放 线 杆 菌 (Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593, 由 本 实 验 室 从 牛 的 瘤 胃 中 分 离 获 得 [5]1.1.2 培 养 基 : 种 子 培 养 基 : TSB (大 豆 胨 胰 酪 胨 蛋Na2S·9H2O( 终 浓 度 0.02%), 以 保 证 绝 对 的 厌 氧 环境 置 于 100% CO2 环 境 中 37C 厌 氧 培 养 24 h 1.2.2 发 酵 产 物 分 析 : 采 用 离 子 排 斥 HPLC 法 分 析 葡 萄 糖 、 丁 二 酸 、 乙 酸 、 乳 酸 、 甲 酸 、 乙 醇 等 发 酵 产 物 [7] 生 物 量 以 660 nm 处 的 吸 光 度 来 表 示 (OD660), 每 个 OD660 对 应 的 菌 体 干 重 为 510 mg ±18 mg 丁 二 酸 的 产 率 (Yield)定 义 为 每 消 耗 1 g 葡 萄 糖 所 产 生 丁 二 酸 的 克 数 [6]。
1.2.3 A. succinogenes 菌 株 发 酵 合 成 丁 二 酸 过 程 的代 谢 网 络 构 建 : 根 据 相 关 。