流式细胞仪对照、仪器设置及阳性判断流式细胞仪对照、仪器设置及阳性判断Holden T. Maecker *, Joseph Trotter BD Biosciences, 2350 Qume Drive, San Jose, California 95131 关键词：阴性对照，设门，特异性，荧光补偿，仪器设置 摘要 摘要：使用流式细胞仪分析的主要目的在于区分细胞对于检测指标是阳性还是阴性，或精确计算阳性细胞与阴性细胞的比例这就需要准确的仪器设置及良好的实验重复性，分析时运用恰当对照及分析方法各种不同的流式细胞仪实验需要不同的阴性对照，因而也是一些争论及讨论的焦点在本教程中，我们将对照划分为不同的种类，介绍了各种类对照的选择条件及其优点 对照样本在流式细胞仪分析中至关重要，因为研究者需要通过它来解释分析样本任何实验可能，或者说需要，最少包括三种对照：设置（仪器）对照，特异性（设门）对照和样本间比较对照在一些情况下，同一个对照管可能具有一种或几种以上的功能设置或仪器对照是指那些用于正常设置（或是检测是否正确）仪器的样本，其中包括光电倍增管电压、增益和荧光补偿的调节特异性或设门对照是指那些用于区分特异染色与非特异性染色的样本。
这些对照常用于设定线性门或图型门的位置换言之，它们是用于决定某些指标阳性或阴性的标准样本间对照是指那些可提供样本间相关对比条件的对照，如未染色的样本或正常人样本在某些情况下，这些对照可作为设门对照使用，如未刺激的样本可作为定义细胞因子分泌阳性/阴性的标准在以下章节中，我们将详细讨论这三种类型的对照设置对照流式细胞仪某些技术参数，如激光器校准、激光时间延迟、灵敏度等需要周期性地校准，但可能不需要在每个实验中都包括这些对照控制、监测这些技术参数暂不在本文的讨论范围之内，所以我们假定流式细胞仪处于良好、稳定的工作状态，并且适当的仪器质控检测在日常中定期执行每个实验可因检测不同的标志物或使用不同的荧光素，而所需特定的设置对照流式细胞仪的设置和优化可因不同的流式细胞仪（模拟或数字）或不同的实验而各不相同（双色或多色实验）但是任何多色实验设置（将发生荧光渗漏）都必须包括两个要素：（1）设定仪器的增益（如光电倍增管的电压）和（2 ）调节荧光补偿因为计算荧光补偿值与电压密切相关，这些步骤必须按步实施，除非流式细胞软件具有随 PMT电压的改变而计算补偿之功能设置光电倍增管电压PMT 电压有时是通过未染色样本中的细胞进行设置的。
在这个方法中，调节要检测荧光的PMT 电压，使未染色的细胞落在四次方对数坐标的第一次方内然而这个方法在一些条件下并不能提供准确结果，它并不是永远有效的此方法特别不适于与在使用长波长荧光素情况下应用，如 APC、CY7、Alexa700 等这是因为在这个波段中，未染色细胞的自发荧光强度几乎接近于零，此时的信号主要是由光电倍增管及电子噪音信号构成如果在这些荧光通道中要通过改变电压将未染色细胞调节到一次方位置中，通常是困难且主观的，它并不与实际中细胞在此通道中信号相一致因此，需要谨慎调节这些通道中电压，确保各个探测器有足够的增益将细胞的弱信号放大而覆盖原来的电子噪音信号在实验中这些探测器的电压设定可由电压基准值开始进行调节对于弱荧光的最低灵敏度或者是检测弱表达群体的能力，可由弱荧光微球的 CV 值来调节在各个荧光通道中，越是高的群体荧光强度，则其中电子噪音信号对于其 CV 的影响就越低通过选择与细胞染色后弱表达荧光类似的微球，然后通过调节探测器的电压将群体调节到不同的区域，就能获得群体 CV 与电压之间的关系图（图 1）通过曲线我们可得知这样一个趋势，样本的 CV 值着增益的增高而降低，只有当电压足够高时，才能使电子噪音信号对样本信号影响最小。
当未染色细胞或弱荧光群体与微球相近时，每个曲线的转折点可视为获得最佳灵敏度时所需的最低电压值此时 PMT 电压可能可作为基准电压来保证仪器在检测弱阳性荧光时具有最高的灵敏度 图 1：（A）通过分析弱荧光微球来显示相应探测的特征[SPHERO 多色校准微球]可见观察到 Log PMT 电压值与荧光强度之间有线性关系标准差和 CV 与荧光强度之间也具有关系因为 log PMT 电压值与荧光强度呈高度线性关系，并且因为标准差被包含于CV 值中，故实验者仅需简单通过 CV 与 PMT 电压之间的图谱来了解探测器的特性使用488nm 激光激发 Peak2 微球，可得到一些通道 CV 与电压值的图谱各个曲线的转折点则代表了各通道获得最佳灵敏度时所需的最低电压值注意此方法仅当荧光微球与染色细胞自发荧光或弱阳性表达强度一致时适用在模拟信号的仪器上，通过检测弱荧光微球的CV 值可以获知电子噪音本底信号，从而来优化 PMT 电压实验者也可以通过检测混合有阴性颗粒和阳性颗粒的样本来获得仪器的信噪比（阳性群体荧光中位值/阴性群体荧光中位值），此时实验者可获得一个与图 1 相反的曲线同样，曲线的转折点也代表着获得最高灵敏度时所需的最低 PMT 电压值。
以上确定 PMT 基准电压的方法并不需要在已有优化检测条件的仪器上执行，除非仪器或分析细胞自发荧光发生了显著改变它只需要在滤光片、PMT、激光器或荧光素改变时需要执行然而这些基准电压在每个实验中并不会自动更新对于某些细胞类型、不同荧光的抗体组合和不同的实验方案（如表面和胞浆内染色），以上方法要作相应的调整这就需要完全染色的样本来识别细胞群体，理想状态中最好在同一实验中存在阴性及阳性的群体当使用仪器基准电压来检测这种完全染色的样本时，在什么情况下还需要进一步调节探测器电压呢？最重要的是如果阳性信号已过高超过坐标时，则需要降低 PMT 电压使所有群体回到坐标轴上这并不是因为美观的原因，而是因为超出坐标的信号无法被统计，并且这些信号还会对其他荧光通道造成影响其二，如果已知的阴性群体出现在荧光高亮区域，你或许需要调低 PMT 电压直至阴性群体的左侧到达在使用基准电压检测的未染色样本群体的右侧边界然而这种方法并不是一直有效的，因为它有可能会引起错误检测已经过荧光补偿的群体当遇到高本底样本时（此时阳性信号仍在坐标轴内），首先建议想办法去除高本底信号，如降低抗体滴度（或选择高效价抗体）、增加洗涤步骤、使用未标记的不相关抗体或 FC 阻断抗体来封闭非特异性结合。
荧光补偿设置荧光渗漏是绝大多数多色实验中不可避免的，很容易发生，需要在随后的数据中通过补偿方法将这些影响去掉最后的结果是，无论细胞群体在别的通道内荧光如何，在一个通道内荧光强度相同的不同细胞群体其平均荧光强度相似尽管多数模拟制流式细胞仪具有荧光补偿电路，但需要注意的是荧光补偿是与实验密切相关的，而非是一种仪器设置各个荧光探测器增益一旦确定后，荧光补偿设置也变得很直观，因为各个荧光渗漏很容易检测到但荧光补偿操作会使阴性群体在一个或多个补偿过的荧光通道中分布分散，但这图形比未经补偿的数据容易分析得多检测荧光补偿调节是否正确需使用某些对照品，最常用的是一组微球或细胞样本--荧光抗体单染某个标志物后检测通过仪器本身或软件可计算出正确的荧光补偿荧光补偿设置一定是在 PMT 电压设定以后进行，因为荧光补偿的多少程度与电压直接相关然而一些新流式用户由于经验问题没有能力在 PMT 电压发生改变后去重新调节荧光补偿在许多情况下，使用单染样本作为补偿对照是有效的这种方法的缺点是必须在原样本中抽取些细胞或另外寻找细胞来源第二年缺陷是，当检测指标是弱阳性/阴性或只有极少细胞表达，这时依靠抗体染色调节补偿就变得十分困难。
如遇这种情况，可使用相同荧光标记的其他抗体来染色作为补偿对照实际上，许多研究者都使用一种抗体，如 CD8（在某些细胞群体上强阳性表达）来调节各个通道的荧光补偿在多数情况下这是一种完美的方法，因为通过相等或更强的荧光信号可精确调节补偿在调节某些复合荧光素的补偿时难度会很大，特别的 APC-Cy7 和 PE-Cy7这些荧光素发射波长的批间差异比较大，会影响荧光渗漏的稳定性，同时它们还受抗体保存和样本染色的影响当使用这些荧光素时，使用不同的抗体来调节补偿可能会影响荧光补偿的精确性有两种类型的微球可用于染色细胞的荧光补偿调节：标记有荧光素的微球，或是能够捕获用户所有荧光抗体的微球前一种微球标有稳定的荧光素在许多检测中可方便使用，通常它是由厂家配套相关的软件自动调节荧光补偿，多见于临床检验科中使用然而当在实验中使用 APC-Cy7 或 PE-Cy7 荧光时，这些样本由于受上面介绍的因素影响，很难在各通道中精确调节荧光补偿因此如果实验中使用这两个荧光素需十分小心捕获微球具有以上两种方法优点：它们像细胞一样与抗体结合，但因为它们与抗体结合没有特异性，所以它们与细胞不同，可为各抗体提供强烈、统一的荧光信号来调节补偿。
并且很少出现细胞染色信号强于捕获微球的情况捕获微球还能与染色样本在同一实验条件下进行操作（固定、破膜、温度、曝光），此法对于复合荧光素也具有高灵敏度使用捕获微球的主要注意点是它们的光散射门与细胞不同，另外它们只捕获某些亚型的抗体（如标有抗小鼠 kappa 轻链的微球难与小鼠抗体结合）详情见 BD Biosciences 公司资料故如要使用这些微球来进行补偿调节需要对捕获微球及抗体有充分的了解 特异性（设门）对照一旦 PMT 电压及样本荧光补偿设定后，便可采集并分析实验样本了此时可能需要对照来帮助设门或确定数据中阴或阳性界线了这些门将回答流式细胞仪分析中最重要的问题：对于某一指标，哪些细胞是阳性或阴性，或多少比例的细胞是阳性的因此，设门对照在分析数据时具有极为重要的作用或许您会问何时设门对照是真正需要的当然，某些门可在没有任何对照情况下任意设定如那些表达明确的生物学指标，阳性与阴性群体没有任何交叉，此时无需对照来准确设定区分阳性或阴性群体最常见的如 T 细胞表面 CD4 和 CD8此处需要注意的是在某些情况下，可能会出现弱阳性表达的细胞群体（如细胞发功能性应答后），此时需要考虑是否要将这此弱阳性群体归入阳性门内。
设门对照在那些阴性、阳性细胞群体分布不清晰的样本中至关重要某些活化标志物，如CD25、CD38、CD69 和一些细胞因子都属于此范畴对于这些标志物的设门对照可能是生物对照样本（未刺激样本或无效刺激样本），或使用更为通用的对照，如同型对照或荧光扣除对照（FMO）同型对照同型对照在流式细胞仪中应用已有很长历史，用于定义某一荧光标记抗体在染色中的非特异性结合找到与抗体匹配的同型对照十分重要，图 2 说明了不同亚型抗体的同型对照具有不同的染色本底然而，即使同型对照与抗体相匹配，使用此同型对照还主要存在两大不足第一个不足是每个荧光标记抗体都具有特定的染色本底，取决于它们的特异性、浓度、聚集程度、荧光分子数量/抗体比例及其他因素因此寻找一个与抗体染色背景完全匹配的同型对照是很难的但是我们却是使用同型对照来帮助定义背景染色的水平，因此这是不足之一第二点不足是同型对照其本身并不能定义由其他荧光通道渗漏而来的荧光这个问题可通过在染色时除同型对照外还加入所有其他通道的抗体来解决但即使这个问题全部解决，仍会受第一点不足的影响，即无法找到与染色抗体背景信号完全一致的同型对照 FMO CONTROLS 当使用一定浓度的高质量荧光标记抗体时，它们此时的染色本底相对较低。
在这种情况下，如果在检测中运用荧光数量>4 时，此时的染色本底基本源于荧光渗漏因为这个原因，使用荧光扣除对照变得流行并更为谨慎FMO 对照是指样本中加入除一个抗体以外的所有染色抗体没有加入抗体的通道中信号则是 FMO 对照所提供的设门界线 了解 FMO 对照能够提供和不能提供什么信息十分重要它能提供测量由其他通道渗漏而来的信号的线索故它在测试新的多色方案，需要在某一通道中获得最高分辨灵敏度时十分重要因为在所研究的通道中并不存在。