单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,4.1,分子发光的基本原理,第一次记录荧光现象的是,16,世纪西班牙的内科医生和植物学家,N.Monardes,，,1575,年他提到在含有一种称为“,Lignum Nephriticum”,的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色直到,1852,年，,Stokes,在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语1867,年，,Goppelsroder,进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝,桑色素配合物的荧光进行铝的测定19,世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到,1928,年，才由,Jette,和,West,提出了第一台荧光计一,.,分子荧光与磷光的产生,1.,单重态与三重态,2.,分子的活化与去活化,3.,分子发光的类型,按激发的模式分类：,按分子激发态的类型分类：,光致发光,化学发光,/,生物发光,热致发光,场致发光,摩擦发光,分子发光,分子发光,荧光,磷光,瞬时荧光,迟滞荧光,按光子能量分类：,斯托克斯荧光,(Stokes),：,ex,em,共振荧光,(Resonance),：,ex,=,em,荧光,分子的活化与去活化,S,0,S,1,T,1,S,2,紫外可见吸收,光谱,外转移,紫外可见共振荧光,光谱,内转移,荧光,系间窜跃,磷光,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,.,辐射跃迁的类型,共振荧光：,10,-12,sec,荧 光：,10,-8,sec ,由第一电子激发单重态跃迁回基态的,任一振动能级所发出的光辐射。
磷 光：,110,-4,sec,由第一电子激发三重态跃迁回基,态的任一振动能级所发出的光辐射无辐射跃迁的类型,振动弛豫,:,V,r,10,-12,sec,外 转 移,:,无辐射跃迁回到基态,内 转 移,:,S,2,S,1,能级之间有重叠,系间窜跃,:,S,2,T,1,能级之间有重叠,反系间窜跃,:,由外部获取能量后,T,1,S,2,二,.,分子荧光,(,磷光,),光谱,1.,荧光,(,磷光,),激发光谱与发射光谱,荧光,(,磷光,),均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光A.,激发光谱,固定,em,=620nm(MAX),ex,=290nm,(MAX),固定发射波长,扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外,-,可见吸收光谱类似,ex,=290nm,(MAX),固定,em,=620nm(MAX),固定,ex,=290nm,(MAX),em,=,620nm,(MAX),B.,发射光谱,(,荧光光谱,),固定激发波长 扫描发射波长,C.,激发光谱与发射光谱的镜像关系,S,0,4,3,2,1,S,1,4,3,2,1,发射光谱的形状与激发波长无关：,分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于,S,1,的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到,S,1,电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。
1,4,1,3,1,2,1,1,1,4,1,4,1,2,1,1,D.,磷光光谱,与发射光谱相同条件下的磷光光谱,激发光谱,发射光谱,2.,三维荧光光谱,I,F,f,(,ex,、,em,),蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,I,F,f,(,ex,、,em,),蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,蒽的三维等高线光谱图,三,.,分子荧光,(,磷光,),强度与荧光物质浓度的关系,1.,荧光强度,(,磷光,),与浓度的关系,光吸收定律,（,Lambert Beer Law,）,相应的吸光分数为：,荧光强度（,I,F,）与相应的吸光分数成正比：,按照级数展开式：,对于稀溶液，当,bc,0.,05,（,磷光,bc,1000,p,(s),2.6,2.5,1.4,0.23,0.014,0.0023,6.,溶剂效应,蓝移,:,E,n*,E,n*,红移,:,E,*,E,*,在极性溶剂中：,无溶剂化作用,有溶剂化作用,三,.,金属螯合物的荧光,1.,螯合物中配位体的发光,2.,螯合物中金属离子的发光,8-,羟基喹啉,弱荧光,8-,羟基喹啉,-Zn,螯合物,黄绿色强荧光,2,2-,二羟基偶氮苯,无荧光,2,2-,二羟基偶氮苯,-Al,螯合物,强荧光,T,1,系间窜跃,S,0,S,1,d,*,、,f,*,d,*,d,f,*,f,荧光,分子内能量转移,四,.,荧光的熄灭,1.,碰撞熄灭,荧 光 熄 灭,：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。
荧光熄灭剂,：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂相对速率,1,K,1,M,*,K,2,M,*,Q,与分子的直径、粘度、温度等因素有关2.,能量转移熄灭,再吸收过程：,共振能量转移：,分子内能量转移：,hv,激发,发射,熄灭,3.,氧的熄灭作用,氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，,4.,自熄灭与自吸收,当荧光物质的浓度大于,1g/L,时，常发生荧光的自熄灭,(,浓度熄灭,),自吸收：,没有除氧，溶液中难以观察到磷光,由于,F,1,，使荧光强度减弱或消失,.,形成二聚体：,由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象4.3,荧光,(,磷光,),分光光度计,一,.,主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理,仪器控制,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,发射单色器,问题：,荧光分光光度计与紫外,-,可见分光光度计有何异同点？,二,.,光源,1.,光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱,光辐射强度随波长的变化小,有足够长的使用寿命,2.,氙灯光源,常用气体放电灯类型：,氙灯光源 高压汞光源,波长范围：,2001000nm,工作压力：,520 atm,启动电压：,2040KV,使用寿命：,10002000h,最广泛应用的连续光源：,发射波长范围宽 发射光强度大,三,.,单色器,平面衍射光栅,线色散率,聚光本领,分辨率,四,.,检测器,光电倍增管,放大倍数：,2,n,5,n,;n=10,10,3,10,7,，最大,10,8,10,9,五,.,样品池：液池、荧光池,1.,样品池的材料：与紫外,-,可见分光光度计的吸收池一样,2.,吸收池的形状：紫外,-,可见分光光度计的吸收池两面透光,荧光分光光度计的样品池,四面透光,波长范围,3.,使用注意事项,容易破碎,问题：,紫外,-,可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,沾污问题,闪跃特性,六,.,磷光分光光度计,1.,光学系统与荧光分光光度计的区别,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,切光器（斩波器）,共振荧光：,10,-12,sec,荧 光：,10,-8,sec,磷 光：,110,-4,sec,迟滞荧光：,10010,-4,sec,2.,样品池与荧光分光光度计的区别,通常情况下，样品池需要放在盛,液氮的石英杜瓦瓶,内，来测定,低温磷光,。
4.,荧光分析法的应用,一,.,工作曲线法,荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高,10,3,10,4,.,荧光熄灭工作曲线法,F,x,F,C,s,C,x,直接荧光标准曲线法,F,C,s,F,x,C,x,二,.,荧光分析法的灵敏度,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物三,.,荧光分析的应用,1.,无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：,Be,、,Al,、,B,、,Ga,、,Se,、,Mg,、,Zn,、,Cd,与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到,10,-10,;,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量较常测定的元素有：,F,、,S,、,Fe,、,Ag,、,Co,、,Ni,、,Cu,、,Mo,、,W,荧光熄灭测定法,自从,1867,年,Goppelsroder,进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝,桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定,70,多种元素催化荧光测定法,较常测定的元素有：,Cr,、,Nb,、,U,、,Te,、,Pb,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。
低温荧光测定法,常测定的元素有：,Cu,、,Be,、,Fe,、,Co,、,Os,、,Ag,、,Au,、,Zn,、,Al,、,Ti,、,V,、,Mn,、,Er,、,H,2,O,2,、,CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度液氮,196,0,C,较常测定的元素有：,Ce,、,Sm,、,Tb,等稀土元素,Sb,、,V,、,Pb,、,Bi,、,Nb,、,Mn,固体荧光测定法,固体荧光发在荧光分析中也经常用到芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型有机化合物,待测物,试剂,ex,max,em,max,测定范围,ppm,丙三醇,苯胺,紫外,蓝色,0.12,糠醛,蒽酮,465,505,1.515,氨基酸,氧化酶,315,425,0.0150,维生素,A,无水乙醇,345,490,020,蛋白质,曙红丫,紫外,540,0.066,肾上腺素,乙二胺,420,525,0.0010.02,青霉素,-,甲氧基,-,-,氯,-,-(-,氨乙基,)-,氨基氮杂蒽,420,500,0.06250.625,玻璃酸梅,3-,乙酰氧基吲哚,395,470,0.0010.033,胍基丁胺,邻苯二醛,365,470,0.055,四氧嘧啶,苯二胺,365,485,10,-4,3.,生命与生物物质,紫外,-,可见分光光度计,:,光源,样品池,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,荧光,(,磷光,),分光光度计,:,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,紫外,-,可见分光光度计,测量池,(,吸收池,),荧光分光光度计,样品池,I,0,I,t,I,0,I,t,I,F,p,。