I加样广 酶（HS） 0.5ul前引物 lul后引物 lulHS（25） dNTP （2.5mM） lul30s/1Kb buffer 5DNA 1ulj 灭菌水 16.5 ul加完样后短暂离心后需将产物置于冰上数分钟后再放进PCR仪；点样时加5ul的marker，根据marker 亮度来估算产物浓度II目的片段回收，依据试剂盒说明书最后一步用加热过的ddH2O溶解III回收的目的片段连接BD载体1.1含pAbAi载体的质粒提取：将-80°C保存的菌液划线（AD、pAbAi涂氨苄抗性的板， BD涂卡那抗性的板），37C培养14-16h，挑取单菌落摇菌，然后按照质粒提取试剂盒提取质 粒即可，将提取的质粒置于-20C保存这里的质粒可以通俗的理解为载体）1.2对连接启动子的做单杂的载体pAbAi进行双酶切，用的是Sall和SacI, 37度酶切3个小时20ulSac I1uLSal I1uL10*T buffer3uLBSA2ulpAbAilugH2OUp to 20ul1.3将双酶切产物全部跑胶，检测是否双酶切成功并回收重点：将 8 管成功双酶切产物跑的胶收集到一个离心管里回收，目的是提高双酶切产物的 浓度（大约 30ng/ul 即可用），记得需要点未双酶切的质粒作为对照；回收后要跑胶检测浓度：1ul双酶切产物+1ulLoading Buffer跑胶，并且15000的Marker 点5ul，根据条带亮度来判断双酶切产物浓度，条带大约7.3kp大小。
双酶切产物一般-20C放置3个月以后连接效率就降低了，所以双酶切的量要酌情控制如果已经有双酶切好的PAbAi载体，则不需要再做1・1-1.3的内容，直接进行1・4的操1.4将PCR扩增成功的目的基因割胶回收后用试剂盒直接连到PAbAi载体上连接体系为：（37°C,30min,也可以过夜）10ul 体系双酶切的 PAbAi1ulExnase1ul5xCE II Buffer2ul插入片段扩增产物2-6ulH2OUp to 10ul图二、从左向右根据条带亮度插入片段扩增产物依次加4ul、6ul、2ul即可III连接产物转化大肠杆菌a将一半的连接产物（5ul）加到感受态细胞中（1.5ml离心管），冰上放置30minb 42°C水浴90s（切勿超过90s）,迅速放回冰上放置2min以上c加入纯的LB液体培养基1ml （或者SOC培养液500ml）,培养箱37C、200rpm震荡1h （这里的时间是不定的，只要菌摇浑浊即可）d 4000rpm离心1min后，倒掉部分上清液，留一部分上清液，涡旋混匀然后涂布到 预先制好的LB固体培养基（含氨苄），37C过夜培养注意事项：感受态细胞脆弱，加样时需要放置冰上，并且直接加至离心管底，新拿出的 感受态需要分装5管，以免反复冻融失效。
IV菌液PCRa挑菌斑：超净工作台上用镊子夹取灭菌白枪头，蘸长出的菌斑，一般挑8个斑，放至加 有40ul含氨苄的LB液体培养基中，37C、200rpm震荡1h至菌液浑浊b菌液PCR （10ul体系））rtaq （premix） 5ul上游引物（通用引物或者目的片段引物）0.25ul下游引物（通用引物或者目的片段引物）0.25ul灭菌水 4ul菌液 0.5ulTips:加0.5ul菌液时直接用挑菌斑时放在离心管中的白枪头即可PCR经验退火温度为58^0V送测将有阳性克隆的40ul菌液（IV a步骤中得到的菌液）超净工作台上分装至两个灭菌1.5ul 离心管，并各加1ml含kana的LB液体培养基，37C、200rpm震荡至菌液浑浊后，一管送 测，另一管4C保存至测序结果出来也可以要求测序公司返还菌液和质粒）VI菌液保存a大肠杆菌菌液需加总浓度20-30%的甘油，封口膜封口标记后-80C保存E.g. 500ul菌液+250ul 75%甘油（超净工作台进行）。