第五章第五章 发酵工程的灭菌与空气净化发酵工程的灭菌与空气净化第一节 常用的灭菌方法（自学）第二节 培养基与发酵设备的灭菌（重点）第三节 空气的除菌（重点）第二节 培养基与发酵设备的灭菌最常用的方法：湿热灭菌，效果最好；培养基灭菌的基本要求：杀死培养基中混杂的微生物，再接入纯菌以达到纯培养的目的一）培养基湿热灭菌原理1.微生物的热阻 温度超过最高限制，细胞中的原生质体和酶的基本成分-蛋白质发生不可逆的凝固变性，M-死亡-湿热灭菌的依据 微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示，热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）的致死时间； 相对热阻：微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值微生物名称微生物名称 大肠杆菌大肠杆菌 细菌芽孢细菌芽孢 霉菌孢子霉菌孢子 病毒病毒相对抵抗力相对抵抗力 1 3 000 000 210 151 3 000 000 210 152.微生物的热死定律-对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）t：时间（min）K-反应速率常数（随微生物的种类和加热温度而变化）对上式进行积分：1k两边取对数：K=N0Nt上式是计算灭菌的基本公式，即对数残留定律。
在灭菌过程中需考虑两个问题： 一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据； 二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中有一次失败3.反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异T相同，k值越小，则微生物越是耐热同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小，温度越高，k值增大细菌芽孢名称细菌芽孢名称 k k值值/min/min-1-1枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌FS5230 3.82.6FS5230 3.82.6硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS1518 0.77FS1518 0.77硬脂嗜热芽孢杆菌硬脂嗜热芽孢杆菌FS617 2.9FS617 2.9产气梭状芽孢杆菌产气梭状芽孢杆菌PA3679 1.8PA3679 1.8121某些细菌芽孢的k值反应速率常数k与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示：K=AeERT-A-比例常数；E-杀死细胞所需的活化能，4.18J/mol；T-绝对温度K；R-气体常数，1.9874.14J/molK二）灭菌温度和时间的计算和选择1.杀灭细菌芽孢的温度和时间温度温度/ / 100 110 115 121 125 130 100 110 115 121 125 130时间时间/min 1200 150 51 15 6.4 2.4/min 1200 150 51 15 6.4 2.4杀灭细菌芽孢的温度和时间需根据试验决定。
大多数细菌芽孢的杀灭温度和时间 100 105 110 115 120 125 130 134100 105 110 115 120 125 130 134炭疽杆菌炭疽杆菌 25 51025 510枯草杆菌枯草杆菌 数小时数小时 4040腐化厌氧菌腐化厌氧菌 780 170 41 15 5.6780 170 41 15 5.6破伤风梭菌破伤风梭菌 590 525590 525韦氏梭菌韦氏梭菌 545 527 1015 4 1545 527 1015 4 1肉毒梭菌肉毒梭菌 300530 40120 3290 1040 420300530 40120 3290 1040 420土壤细菌土壤细菌 数小时数小时 420 120 15 630 4 1.510420 120 15 630 4 1.510嗜热细菌嗜热细菌 400 100300 4110 1115 3.98.0 3.5 1400 100300 4110 1115 3.98.0 3.5 1生孢梭菌生孢梭菌 150 45 12150 45 12温度芽孢名称灭菌时间某些细菌芽孢在湿热灭菌时的死亡温度和时间2.培养基灭菌温度的选择 在生产中必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。
培养基营养成分的分解的动力学方程符合一级分解反应动力学：-dC/dt = kC（C/C0）=-Kt-dC/dt -营养物降解速率，mol/Lh；C-营养物浓度，mol/L；K-营养物降解反应速率常数，l/s；t-时间，s 在化学反应中，其他条件不变时，则反应速率常数的关系同样可用阿雷尼乌斯方程式表示：K= A e-E/RTA-比例常数；R-气体常数，J/molK；T-绝对温度；E-营养物破坏所需的活化能，J/mol 随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加的倍数，即杀死微生物速率的提高超过培养基成分破坏速率的增加， 达到相同的灭菌效果时，T k t ，因此采用高温短时（HTST）灭菌效果好 （三）影响培养基灭菌效果的因素除了灭菌时间和温度外，还有：1.培养基成分 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，微生物的热死亡速率就越慢高浓度的盐类、色素等的存在会削弱微生物细胞的耐热性，故一般较易灭菌如：E.coli：在水中加热606510min就死亡；在10%的糖液中，需70 46min；在30%的糖液中，需70 30min2.培养基的物理状态培养基的物理状态 固体培养基比液体培养基灭菌时间长；固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗粒培养基，不必考虑颗粒对灭菌的影响，的颗粒培养基，不必考虑颗粒对灭菌的影响，但含有少量大颗粒和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培但含有少量大颗粒和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。
菌不彻底3.pH 培养基的pH越低，灭菌所需的时间就愈短，pH68时，微生物最耐热；pH6，氢离子易渗入微生物细胞内，从而 改变微生物的生理反应促使其死亡4.培养基中微生物数量微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长培养基中微生物孢子数培养基中微生物孢子数/ /（个（个/ml/ml） 9 900 90 000 9000 000 900 000 0009 900 90 000 9000 000 900 000 000105105灭菌所需时间灭菌所需时间/min 2 14 20 36 48/min 2 14 20 36 48培养基中微生物孢子在105 灭菌所需时间灭菌所需时间在实际生产中，不宜采用严重霉变的原料和腐败的水质5.微生物细胞含水量含水量越少，灭菌时间越长水分（水分（% % ） 50 25 18 6 050 25 18 6 0凝固温度凝固温度 56 7478 8092 145 16017056 7478 8092 145 160170卵蛋白凝固时水分与温度的关系6.微生物的菌龄 微生物细胞的菌龄不同对高温的抵抗力不同，年老的细胞对不良环境的抵抗力要比年轻细胞强，7.微生物的耐热性 各种微生物低热的抵抗力是不同的：细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感；放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性要强，细菌的芽孢的抗热性就更强。
8.空气排除情况 温度 罐内的蒸汽压力9.搅拌 灭菌过中，培养基在罐内保持均匀充分翻动，除搅拌外，还必须正确控制进排汽阀门，保持在一定温度和罐压，是灭菌的要点之一10.泡沫 泡沫对培养基灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔层，使热量难易传递，热量难易渗透进去，不易达到微生物的致死温度，导致灭菌不彻底；泡沫的形成主要是由于进排气不均衡而致二、发酵培养基灭菌工艺（一）间歇灭菌1.间歇灭菌的温度变化 间歇灭菌也叫分批灭菌或实罐灭菌 培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程2.间歇灭菌的计算 若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间 例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121下进行实罐灭菌原污染程度为每毫升2105感染耐热细菌芽孢， 121时灭菌速率常数为1.8min-1，求灭菌失败概率为0.001时所需要的灭菌时间解：N0=40 106 2105（个） Nt=0.001（个） k=1.8min-1灭菌时间：t=N0Nt1k=2.303 1.8（81015）=20.34（min）3.间歇灭菌的工艺操作操作过程：操作过程：操作过程：操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。
空罐准备：清洗、检修和检测空罐准备：清洗、检修和检测空罐准备：清洗、检修和检测升温：把培养基加热到灭菌所需的温度升温：把培养基加热到灭菌所需的温度升温：把培养基加热到灭菌所需的温度升温：把培养基加热到灭菌所需的温度保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度三路进汽：三路进汽：直接蒸汽直接蒸汽从通风、取样和出料从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，直到所规定的温度，并维持一定的时间并维持一定的时间这就是所谓的这就是所谓的“三路三路进气进气”四路出汽：四路出汽：直接蒸汽直接蒸汽从排气、接种、进料从排气、接种、进料和消沫剂管排气和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图分批灭菌设备示意图优点： 不需要专门的设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，而且灭菌效果可靠二）连续灭菌1.连续灭菌的温度变化 培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图2.连续灭菌的计算连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。
例：发酵罐内装40 m3培养基，在温度131下进行连续灭菌原污染程度为每毫升2105感染耐热细菌芽孢， 131时灭菌速率常数为15 min-1，求所需要的灭菌时间解：c0= 2105（个/ml） ct=1 /40 106 103 =2.5 10-11 （个/ml） k=15min-1灭菌时间：t=C0Ct1k=2.303 15（ ）=2.37（min）21052.5 10-113.连续灭菌的工艺流程配料预热罐：预热到6070，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声音连消塔：使高温蒸汽与料液迅速解除混合，使料液温度很快上升到灭菌温度（126132）套管式连消塔维持罐：使料液在灭菌温度下保持57min，以达到灭菌目的；冷却管：生产上一般采用冷水喷淋冷却到4050后，输送到预先灭菌过的罐内典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图喷射加热连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图薄板换热器连续灭菌流程（三）间歇灭菌和连续灭菌的比较灭菌方式灭菌方式优点优点缺点缺点连续灭菌连续灭菌 1. 1.灭菌温度高，减少营养物质损失灭菌温度高，减少营养物质损失2. 2.操作条件恒定，灭菌质量稳定操作条件恒定，灭菌质量稳定3. 3.易于实现管道化和自控操作易于实现管道化和自控操作4. 4.避免反复加热和冷却，提高热的避免反复加热和冷却，提高热的利用率利用率5. 5.发酵设备利用率高发酵设备利用率高1. 1.对设备要求高，需要设置加热和对设备要求高，需要设置加热和冷却装置冷却装置2. 2.操作麻烦操作麻烦3. 3.染菌的机会多染菌的机会多4. 4.不适合含大量固体物料的灭菌不适合含大量固体物料的灭菌5. 5.对蒸汽的要求高对蒸汽的要求高间歇灭菌间歇灭。