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人小肠黏膜潘氏细胞形态学和功能作用研究

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中山大学硕士学位论文人小肠黏膜潘氏细胞形态学和功能作用研究姓名:杨斌申请学位级别:硕士专业:外科学指导教师:陈双20060506中山大学硕士学位沦文中文摘要人小肠黏膜潘氏细胞形态学和 功能作用的研究中山大学附属第二医院普通外科 硕士研究生杨斌导师陈双主任医师中文摘要研究背景:人及哺乳动物的肠道是与外界环境相通的表面积最大的器官,在漫长的进化过程中,肠道已经形成了完整的黏膜屏障,在机体应激等疾病状态下,肠黏膜屏障常常遭受破坏I 临床观察可以发现,1 ) 、住院病人发生的感染性并发症主要是由肠内细菌引起,肠黏膜上皮的通透性增加常可导致危重患者肠内细菌移位( B a c t e r i a lt r a n s l o c a t i o n ,B T ) ,形成所谓“肠源性感染”2 ) 、机体应激条件下,肠黏膜出现缺血一再灌注损伤( I /R ) ,局部产生大量的细胞因子,炎症介质等,进而可能引发全身炎症反应综合症( S I R S ) 、脓毒症、多脏器功能障碍综合症( M O D S ) 等严重情况而危及生命因此,人们逐渐认识到肠道是机体应激反应的中心器官,甚至被称为M O D S 的“始动器”( t r i g g e r ) ,其致病作用不容忽视,对肠黏膜屏障功能的研究已成为当今的热点之一。

正常人的小肠黏膜上皮主要由四种细胞组成:肠上皮细胞( 吸收细胞) 、杯状细胞、内分泌细胞和潘氏细胞( P a n e t hc e l l s ,P C s ) ,这些细胞共同起源于小肠隐窝中下部增生带( P r o l i f e r a t i o nz o n e ) 的多能干细胞,肠黏膜具有高代谢及绒毛微血管结构的特性,在机体一生中不断地更新多年以来,众多的学者对肠屏障进行了广泛而深入的研究现已知肠黏膜屏障包括机械屏障、黏液屏障、免疫屏障、微生态屏障、化学屏障等部分其中潘氏细胞是肠黏膜屏障重要的组成基础潘氏细胞作为肠道天然黏膜免疫屏障中关键的细胞分子组成成分,位于小肠L i e b e r k i i h n 隐窝的基底部,细胞内含有大量的分泌颗粒,研究发现其分泌颗粒中含有n .防御素( a .d e f e n s i n s ) 或称隐窝素( c r y p t d i n s ) 、溶菌酶( L y s o z y m e ,L Z M )I I中山大学硕士学位论文中文摘要和分泌型磷脂酶A 2 ( s e c r e t o r yp h o s p h o l i p a s e ,s P L A 2 ) 等抗菌肽。

在某些特定的条件下,潘氏细胞可以脱颗粒形式将上述物质释放入肠腔,对维护肠屏障功能具有十分重要的作用既往我们在有关肠黏膜屏障的系列研究中发现,大鼠小肠黏膜具有强大的修复潜能,在失血性休克模型中,肠缺血再灌注损伤( I /R ) 后的上皮细胞很快即得到快速重建;而肠黏膜潘氏细胞颗粒的合成和分泌与失血性休克缺血/再灌注肠损伤( I /R ) 有关潘氏细胞可表达肠防御素,肠三叶因子,骨桥蛋白等,对黏膜上皮细胞的修复、重建具有重要作用,而且,小肠上皮细胞更新这一重要的过程始发于隐窝部位因此,我们推测潘氏细胞可能对促进肠粘膜上皮分化、成熟等方面具有重要的调控作用但纵观国内、外有关潘氏细胞的研究对象主要局限在动物个体,可能受标本取材限制等原因,很少有关于人类潘氏细胞的研究报道我们检索近2 0 年来国内的有关研究,未有关于人类小肠潘氏细胞形态学方面的研究为此,在前期研究的基础上,我们应用免疫组织化学等方法,观察人小肠各段潘氏细胞的分布,并通过对小肠潘氏细胞分泌状态与黏膜上皮细胞增殖之闻的关系进行相关性分析,探讨潘氏细胞在肠道防御功能中的作用及其临床意义研究目的l 、观察并比较人小肠各段潘氏细胞的分布,形态结构特点。

分析与其功能之问的关系2 、通过透射电子显微镜展示处于不同分泌时相的人小肠潘氏细胞的超微结构等形态学特点3 、观察并分析潘氏细胞脱颗粒与小肠黏膜上皮细胞增殖状态之间的关系实验方法一、材料和方法1 、1 实验标本选取及分组:取自中山大学附属第二医院2 0 0 5 年3 月至2 0 0 5 年l O 月间,胃肠胰外科病人手术切除的小肠标本共2 4 例,其中包括十二指肠8 例,空肠8 例,回肠8 例8 例十二指肠标本及8 例空肠标本来源于5 位男性( 平均年龄5 1 .8 ±8 .0 岁) ,3 位I l I中山大学硕士学位论文中文摘要女性( 平均年龄5 3 .6 ±1 1 .0 岁) ,病种包括胃、十二指肠肠良性溃疡4 例,早期胃癌4 例,均行毕I I 式胃一空肠吻合,分别取十二指肠残端及距离T r i s 韧带1 5 - 2 0 c m 处的空肠黏膜一小块8 例回肠标本来源于6 位男性( 平均年龄5 5 .6 ±1 2 .0 岁) ,2 位女性( 分别6 l ,5 3 岁) ,手术病种包括升结肠癌4 例,升结肠多发性憩室1 例,均行右半结肠切除术;因直肠癌行预防性回肠造口后,回肠末端关瘘术3 例;分别取距离回盲部1 0 —1 5 c m 的末端回肠或回肠造瘘口近端黏膜各- - + 块.所有标本经病理学检查证实为正常小肠黏膜组织.三组患者在年龄和性别分布、疾病构成,分期及有无其它共患病等方面差异无显著性。

排除激素,免疫抑制剂等药物及炎症性肠病等疾病因素的影响,所有患者术前未接受过放疗、化疗及抗生素治疗l 、2标本处理标本切除后立即投入液氮中,后转移至一8 0 C 冰箱冷冻保存直至使用取所存标本经冷生理盐水漂洗5 分钟后,1 0 %中性福尔马林溶液固定2 4 小时以上,脱水,然后行常规石蜡包埋制成3 - 5 u m 石蜡切片后,苏木素一伊红( H E ) 染色,行常规病理组织学检查和增殖细胞核抗原( P C N A ) 、溶菌酶( L y s o z y m e ) 免疫组化染色检测l 、3 人小肠黏膜潘氏细胞( P C s ) 及人回肠上皮增殖细胞核抗原( P C N A ) 免疫组化染色人小肠黏膜潘氏细胞( P C s ) 染色采用溶菌酶免疫组化染色方法免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司石蜡包埋的组织块在切片机上行3 ~5uI T I 切片;常规脱蜡,梯度乙醇水化;磷酸盐缓冲溶液( P B S ,p H 7 .4 ) 冲洗3 次,每次5 分钟( 下同) ;微波热修复抗原3 0 分钟,每张切片加5 0 u l 过氧化酶阻断溶液,室温孵育l o 分钟;P B S 冲洗3 次;加5 0 u l 的正常非免疫动物血清,室温孵育1 0 分钟,倾去血清,勿洗;加5 0 u l 的L y s o z y m e 多克隆抗体或P C N A 单抗,4 。

C下孵育过夜;P B S 洗3 次:加5 0 u l 生物素标记的第二抗体( 试剂C ,黄色液体) ,室温下孵育3 0 分钟;P B S 洗3 次;加5 0 u l 链霉素抗生物素.过氧化酶溶液,室温下孵育3 0 分钟;P B S 洗3 次;每张切片1 0 0 u l 新鲜配制的D A B 溶液,显色3 一l o分钟;自来水充分冲洗1 0 分钟;苏木素复染2 分钟;P B S 或自来水冲洗返蓝;梯I V中山大学硕士学位论文中文摘要度酒精脱水干燥:透明:中性树胶封固用P B S 代替一抗作为阴性对照,以淋巴瘤组织作为P C N A 阳性对照1 、4人小肠潘氏细胞计数及回肠黏膜上皮细胞P C N A 增殖指数检测在普通光镜下观察十二指肠,空肠,回肠P C s 的形态、结构特点、分泌颗粒的染色情况及分段细胞记数:溶菌酶阳性的潘氏细胞计数( x ±S ) :1 0 X 4 0 视野下观察,按确定的方向依次计数1 0 个结构显示良好,染色清晰的隐窝腔,计算其中L Z M 染色阳性P C s 数量,总数即为每1 0 个隐窝L Z M 染色阳性的P C s 数,每组大鼠可得8 个数值计量资料以X ±S D 表示。

细胞核着棕黄色判定为P C N A 阳性染色细胞,每张回肠P C N A 染色切片随机选择5 个高倍视野,每个视野选择3 条绒毛,计数每条绒毛中阳性细胞数和总细胞数,P C N A 指数= 阳性细胞数,总细胞数×1 0 0 %1 、5人小肠潘氏细胞颗粒分泌状态分析采用K o n t r o n I B A S 2 .0 全自动图像分析系统,在4 0 ×1 0 倍视野下观察,每张回肠潘氏细胞L y s o z y m e 免疫组化切片随机选取5 个视野,测算每- - N 试区域的灰度级G 和面积( m + n ) 、阳性反应产物的灰度级G 和面积n ( 或背景面积m ) 测试仪器最大灰度分级( G m a x ) 为2 5 6 应用免疫组织化学定量计算公式:P U = 1 0 0×I G a —G A l /G m a x ×『1 - ( n /m + n ) l ,导出阳性单位( P U ) 数值,每张切片均可得出一平均P U 值,其数值大小即可说明潘氏细胞颗粒含量的多少并进一步分析潘氏细胞的颗粒分泌状态与小肠黏膜上皮细胞增殖之间的关系1 、6透射电镜下人回肠潘氏细胞超微结构特点另取回肠l m m ×1 m m ×2 r a m 大小的组织块置2 .5 %戊二醛中固定,透射电镜下观察不同分泌时期P C s 超微结构特征。

二、检测指标:l 、光镜下观察人小肠各段潘氏细胞的形态结构特征及分布V中山大学硕士学位论文中文摘要2 、透视电镜下观察不同状态下人潘氏细胞的超微结构特征3 、人回肠黏膜上皮细胞P C N A 增殖指数的检测4 、图像分析系统对潘氏细胞颗粒进行定量分析,并分析潘氏细胞脱颗粒与小肠黏膜上皮细胞的增殖及多能干细胞之间的关系三、统计学处理:计量资料采用t 检验,多组的P C s 计数采用单因素方差分析,组间比较采用L S D - t 检验,相关性用S p e a r m a n 等级相关检验;P 2 4 h ,乙醇梯度脱水,环氧树脂E p o n 8 1 2 包埋,L K B 超薄切片机切片,厚度O .0 5 I .t m ,枸橼酸铅,醋酸铀双染各1 0 分钟,电镜下观察回肠形态结构特点,分析、描述小肠黏膜机械屏障的构成,潘氏细胞各分泌相的超微结构特点三、统计学处理:计量资料采用t 检验,多组的潘氏细胞计数采用单因素方差分析,组间比较采用L S D —t 检验,相关性用S p e a r m a n 等级相关检验;P < 0 .0 5 为差异有显著性,P < 0 .O l 为差异有明显显著性。

上述检验均采用S A S 8 .1 版本统计软件包在电脑上运行中山大学硕士学位论文结果第三章结果一.人小肠潘氏细胞免疫组化染色结果的观察光学显微镜下可见P C s 内分泌颗粒呈棕红色,细胞核呈蓝色.正常人小肠黏膜中P C s 存在于大多数隐窝的基底部,呈簇状分布.切片中结构显示良好的隐窝均可见L Z M 阳性的P C s ,每个隐窝中P C s 数量约为3 ~1 0 个隐窝基底部之外的部位未见P C s 切片中P C s 为下宽上窄,略呈锥状,核为圆形或卵圆形,位于细胞基底部,胞质中有大量的L Z M 阳性的分泌颗粒,占据核上胞质空间的大部分,未见核上空泡( 见图1 ,2 ,3 ) 各段小肠中潘氏细胞形态无明显差异结肠切片中未见L Z M 阳性的细胞( 见图4 ) 从十二指肠,空肠到回肠,潘氏细胞的数量逐渐增多,且各组之问有显著性差异( P < 0 .0 5 ) ( 表1 ) 二、人回肠黏膜上皮细胞P C N A 增殖指数光镜下可见P C N A 主要位于隐窝增殖细胞的核内,呈棕色,胞浆和胞膜不被染色( 见图5 ,6 ) 回肠隐窝基底部P C N A 染色表现为强阳性,而绒毛部分的上皮细胞P C N A 染色几乎呈阴性。

三.透射电镜下人潘氏细胞超微结构特点电镜下,分泌期潘氏细胞形态为锥形呈柱状,胞浆顶部充满了颗粒状的电子致密物,呈现为多形性,较正常颗粒小,且数量减少。

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