中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群SN 0169—92和大肠杆菌检验方法代替 ZB X09 002一88Method for examination of coliform, fecal coliformand escherichia coli in food for export━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法本标准适用于出口食品的检验2 设备和材料2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度2.2 水浴箱:44.5±0.5℃2.3 培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃2.5 均质器2.6 乳钵和研棒2.7 平皿:直径90mm2.8 天平:感量0.1g2.9 显微镜2.10 稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶2.11 玻璃珠:直径约5mm2.12 菌落计数器3 培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示(LST肉汤3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB肉汤。
3.3 EC 肉汤3.4 伊红美蓝琼脂(EMB3.5 营养琼脂斜面3.6 色氨酸肉汤3.7 MR-VP培养基3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液3.11 生理盐水3.12 革兰氏染色液3.13 Kovacs氏靛基质试剂3.14 甲基红指示剂3.15 Voges-pros kauer(V-P试剂4 样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存检验前冷冻样品可于2~5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠, 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇,制成1:10的样品匀液4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min5 大肠菌群的测定5.1 大肠菌群MPN值的测定5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示(LST肉汤,每管接种1mL5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST 肉汤管数如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一步作证实试验5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB肉汤管中5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数5.2.4 结果报告:按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件]报告每克(毫升样品中大肠菌群的MPN值6 粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照6.3 记录EC肉汤管的产气情况产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性6.4 结果报告:按产气管数,查MPN表报告每克(毫升样品中粪大肠菌群的MPN值7 大肠杆菌测定7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB 平板,36±1℃培养24±2h7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验7.4.1 色氨酸肉汤:在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应7.4.2 MR-VP培养基:在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm 试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤:于36±1℃培养96h记录有无生长7.4.4 LST肉汤:于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气7.4.5 革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色大肠杆菌为革兰氏阴性7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基质┃ MR ┃ VP ┃枸椽酸盐┃ 鉴定(型别━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃ -┃ -┃典型大肠杆菌-┃ +┃ -┃ -┃非典型大肠杆菌━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━+┃+┃-┃ +┃典型中间型-┃+┃ -┃ +┃非典型中间型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━-┃-┃+┃+┃典型产气肠杆菌+┃-┃ +┃ +┃非典型产气肠杆菌━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。
7.5 结果报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升样品中大肠杆菌MPN 值8 大肠菌群固体培养基测定法8.1 样品制备同第4章8.2 计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA10~15mL倾注于每个平皿中小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀8.2.3 待琼脂凝固后,再加3~4mL VRBA覆盖平板表层8.2.4 翻转平板,置于36±1℃培养18~24h8.2.5 选用有30~150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环菌落直径为0.5mm或更大8.2.6 证实8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升样品中大肠菌群数例:10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×10**4/g(mL=6.0×10**5/g(mL附录 A培养基和试剂(补充件A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示(LST肉汤胰蛋白(月示或胰酪胨(Trypticase 20g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4 2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL121℃高压灭菌15min最终pH6.8±0.2A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB肉汤蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile溶液 200.0mL0.1%煌绿水溶液 13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0~7.5,用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。
再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管中,每管10mL121℃高压灭菌15min最终pH7.2±0.1A3 EC肉汤胰蛋白(月示或胰酪(月示 20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4 4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4 1.5g氯化钠 5.0g蒸馏水 1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管,每管8mL121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1A4 伊红美蓝琼脂(EMB蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4 2.0g琼脂 15.0g伊红γ(水溶性 0.4g或2%水溶液20mL美蓝 0.065g或0.5%水溶液13mL蒸馏水 1000.0mL在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量分装于三角烧瓶中每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min最终pH7.1±0.2使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红γ水溶液和1.3mL0.5%的美蓝水溶液,摇匀,冷至45~50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000.0mL将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解分装合适的试管121℃高压灭菌15min最终pH7.3±0.1灭菌后摆成斜面备用A6色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 10.0g蒸馏水 1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中分装试管,每管5mL121℃高压灭菌15min最终pH6.9±0.2A7 MR-VP培养基(月示胨7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4 5.0g蒸馏水 1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2A8 Kos。