第四章 屏障系统实验 动物饲养与管理第一节 基础知识屏障环境设施适用于饲育无特定病源体(Specific Pathogen Free)级实验动物动物来源于无菌、悉生动物或SPF动物 种群进入屏障的人、动物和物品必须经过严格的微生物 控制空气经低效、中效、高效过滤器进入屏障系统，结 净度达到10000级，利用空调送风系统形成清洁走廊、动 物房、污染走廊、室外的静压差梯度，以防止空气逆向形 成的污染空气、人、动物、物品的走向采用单向流通路 线空气经初效、中效和高效过滤器静茹动物饲养室或实 验室，检测尘埃粒子数在350/升，该系统利用空调送风系 统形成清洁走廊、饲育室或实验室、污染走廊灯不同压力 的净化区，净化区内形成梯度压差，一般压差为20Pa工 作人员工作时要在淋浴后穿着无菌工作服、口罩、帽子以 尽量减少和动物的直接接触 实验动物环境控制的重要性实验动物几乎终身被限制在一个极其有限 的环境范围内生活，这种环境就成了实验 动物赖以生存的条件动物实验在实验前 和实验中控制各种环境因素十分重要甚 至可以说没有环境控制就没有动物实验动物对实验处理的反应可用以下公式表示：R = （A+B+C）× D + E R：实验动物的总反应 A：动物种的共同反应 B：品种品系特有的反应 C：个体反应（个体差异） D：环境影响 E：实验误差环境因素与动物的总反应呈正相关，要尽量减 少D的变化，排除实验处理以外的影响。
实验动物环境因素的分类 1、气候因素：温度、湿度、气流、风速等； 2、理化因素：氧、二氧化碳、粉尘、臭味、噪音、 照度、杀虫剂、消毒剂、有害化学物质等； 3、居住因素：房屋、笼具、垫料等； 4、营养因素：饲料、水等； 5、生物因素：同种生物因素：社会地位、势力范围、咬斗和饲养 密度等异种生物因素：微生物、人和其它动物的关系 环境对实验动物质量和动物试验结果的影响是多因 素联合作用的结果多种因素是共存的所以在 论述实验动物的环境时，应该按复合环境（ environmental complex)状态加以考虑各种环境因素对实验动物质量和动物试验结果的影 响 1、温度： 最适宜温度20-25℃，温差：3或4℃ 温度对动物的影响： 新陈代谢：低温时新陈代谢增加，摄食增加 散热：除灵长类，其他动物汗腺不发达或无汗腺， 高温时散热困难，难以维持体温恒定 脏器重量：负相关 生殖：高温时雄性睾丸萎缩，精子活力下降；雌性 动物性周期紊乱，泌乳下降 对动物实验的反应性实验动物的温度标准范围：2、湿度： 相对湿度， 实际水蒸气分压力相对湿度（%） = ------------------ × 100%饱和水蒸气分压力适宜的相对湿度是40%--70%。
高温高湿导致机体蒸发散热受阻高湿利 于微生物繁殖和传播湿度过低可导致粉尘飞扬，而微生物主要 附着在粉尘上，动物室内变态反应原的含 量随湿度的下降而上升低湿，散热增加，产热增加，摄食增加低湿，大鼠环尾症3、气流与风速换气次数，气流速度，压强梯度气流速度和散热正相关，实验动物体表面积与体重 的比值较大，对气流速度更敏感 气流速度过 大或气流直吹，动物体表散热过大气流速度小 ，散热慢0.1-0.2m/s换气次数，洁净程度越高，要求换气次数越多屏障环境：10-20次/h 隔离环境： 20-50次/h.压强梯度：洁净区高于污染区 合理组织气流和风速可调节室内温度和湿度，又可 降低室内粉尘和有害气体污染，控制传染病的流 行4、光照 工作照度150—300lx 动物照度15－20lx 明暗交替时间12/12或10/14h照度对动物的生殖生理和行为活动有较大影 响强光长时间照射引起角膜退行性变化5、噪声 60dB以下音域，人1000~2000Hz,小鼠1000~5000Hz引起小鼠听力性痉挛对生殖影响较大，如豚鼠流产引起动物呼吸、心跳、血压、肾上腺皮质激 素等生理指标变化6、空气洁净状况 气体污染， 氨14mg/m3有害气体，氨、甲基硫醇、硫化氢等颗粒污染，100级，10000级，100000级美国宇航局标准，每立方英尺空气中直径0.5微米以上粒子的个数。
粉尘颗粒，是变应原，还是微生物的主要载体 落下菌数，0（隔离环境），3（屏障环境），或30 个/皿（普通环境）在不饲养动物的状态下每5～10m2放置1个直径9cm 的血琼脂培养皿，暴露30min培养48h的菌落数7、生物因素 动物社会因素和动物饲养密度 微生物 其它动物 实验人员8、居住因素包括实验动物室的建筑、饲养笼具、垫料 、饮水器和给食器等动物试验设施环境指标：﹝ ﹝以屏障系统小鼠为例﹞﹞温度：20~25℃ 换气次数：10~20 次/h 日温差：≤ 3 ℃ 气流速度：0.1~0.2 m/s 相对湿度：40~70% 压强梯度：20~50 Pa 噪声： ≤ 60dB 空气洁净度：10000级 氨浓度： ≤ 14 mg/m3 落下细菌数： ≤ 3个/皿 照度：（工作）150~300 lx （动物）15~20 lx 昼夜明暗交替时间：12/12或10/14 小时 密度（>20g):面积0.01m2,高度0.15m实验动物设施laboratory animal facility,LAF是进行实验动物饲养、保种维持、生产、 实验研究、试验等设施的总称。
包括实验 动物繁育、生产设施和动物实验设施 实验动物设施根据对饲养动物的空气净化程 度分为三类： 开放系统(open system) 屏障系统(barrier system) 隔离系统(isolation system)实验动物屏障环境特点：恒温（20～26）恒湿（40％～70％） 足够的换气次数（10～20次/小时）保证有害 气体浓度降低到最小 正向梯度压差（20～50)使屏障外污染源不能 进入 万级空气洁净度保证空气洁净 适合的动物照度(15~20)和对时明暗交替（ 12h/12h)符合动物生活习性第二节 屏障系统的环境控制与管理一、人流路线二、物流路线三、消毒与灭菌 高压锅：121℃，0.11Mpa，30分钟132 ℃，0.21Mpa，15分钟 传递窗：紫外线，表面消毒，30分钟 渡槽：0.1%新洁尔灭浸泡4小时 Co60照射 2%过氧乙酸喷雾高锰酸钾、福尔马林熏蒸四、废弃动物处理深埋或焚烧屏 障 系 统（ Individually Ventilated Cages 简称 IVC ）是独立通风笼盒的简称.它的特点是具有一 定的密闭性,同时让经HEPA过滤器的洁净空气流 入盒内,使盒内保持正压,减少了可能的感染来源,适 合于饲养SPF级动物,以及一些免疫缺陷动物。
IVC的使用要点： 对IVC中的动物进行的一切工作均在动物超 净工作台中进行 使用超净工作台前30分钟用70%酒精喷雾工 作站内表面，同时放入经表面消毒的各种 灭菌物料和实验用品，并打开紫外灯和风 机 用70%酒精喷雾工作车、双手手套和IVC的外 表面，将笼盒移入工作台后进行换窝，喂 饲，喂水，实验等工作层流架隔 离 系 统隔离器的基本构造示意图隔离器的基本构造示意图引进动物进入清洁级屏障动物房： 从外面引进的动物必须有与其适用范围相符 的实验动物生产许可证,同时必须附带动物 的品系、性别、年龄等信息经实验动物中 心工作人员审查后方可准备进入动物房 动物运输时必须有合格的包装箱,清洁级及以 上动物包装箱必须以高效滤膜封闭窗口， 包装箱以胶带封口，封口破损或滤膜破损 者不得传入屏障系统将检查合格的动物包 装箱在外准备间以 70％酒精棉球或5% 碘伏仔细擦拭表面, 将包装箱放入灭菌 通道进行喷雾消毒 或紫外线消毒在内准备间打开灭菌通道的门→ 在门口拆开包装箱→轻轻提起 鼠尾根部，放入准备好的盒子 中，盖好盖子→动物包装箱仍 退回灭菌通道→将刚装了动物 的笼盒放在架子上→并填写、 悬挂卡片，加饲料，饮水→从 外准备间打开灭菌通道，取出 动物包装箱。
注意：新引进动物应在单独房间，单独笼架饲养一段 时间,待观察健康无病后再移入其它房间 不得向屏障动物房内传入不符合相应的实验动物生产 许可证的动物！实验用品和器具进出清洁级屏障动物房： 用70%酒精或5 %碘伏仔细擦拭消毒物品表面 紫外灯照射15min 或直接喷雾消毒手术器械可经高压消毒或经消毒液中浸泡后 在紫外灯下照射15min传入 小型仪器经灭菌通道喷雾消毒后传入物品进出SPF动物实验室：所有物品在经过进入屏障系统时的一次消毒 后,在进入超净工作台时必须经过酒精喷雾 或紫外线照射15min再次消毒实验用品和器具在实验结束后可经内准备间 从传递窗或灭菌通道传出，也可经缓冲间 Ⅲ出屏障系统第三节 屏障与隔离系统的实验动物 饲养管理技术一、无菌动物（Germfree animal，简称GF） 定义：指用现有的实验手段检测，动物的体表体内 不携带其它生命体（包括一切微生物和寄生虫） 的实验动物 饲养条件：无菌隔离器内 来源：第一代通过无菌剖腹产术，人工哺乳获得； 以后通过无菌动物雌雄交配繁殖或无菌剖腹产术， 保姆鼠代奶扩群无菌动物的培育无菌动物的理论基础和实践依据：胎盘屏障和 屏障观念 1、无菌手术小哺乳动物动物：子宫切除术（剖腹产） 大哺乳动物动物：子宫切开术（剖腹产） 鸟类：消毒卵 2、哺乳人工哺乳 代乳 3.放入隔离器进行饲养注意： 供胎动物：不携带垂直传播的微生物 手术时间的选择 手术速度 无菌操作 环境温度 防止羊水呛入呼吸道 手术后微生物的检查 代乳动物的准备无菌动物特点： 1.微生物特点：在动物体内外任何部位均 检不出任何活的微生物和寄生 虫。
无菌”是个相对的概念，只是根据现有的科学知识和检验 方法在一定时期内不能检出病 原体而已随着科学技术的发 展，现在认为是无菌的动物或 许将来可以检出病原体而不是 无菌动物2.形态学特点： 消化系统 (1)盲肠肥大，(2)肠道肌层薄，肠绒毛变细变短(3)肝脏变小 循环系统(1)心脏变小(2)白细胞数变少，且数量波动范围小 免疫系统(1)胸腺，淋巴组织，网状内皮系统发育不良 (2)脾脏小，无二级滤泡2.生理学特点：免疫功能(1)血清中IgG、IgM水平低，几乎不存在丙种球蛋白 和特异性抗体(2)免疫应答速度慢，过敏反应、对异体移植物的排 斥反应以及自身免疫现象消失或减弱 生长率(1)不同种属不同(2)无菌鸟类生长率高于同种普通鸟(3)无菌大、小鼠与普通鼠差不多(4)无菌豚鼠和无菌兔比普通的慢生殖 (1)无菌大、小鼠略高于普通大小鼠 (2)豚鼠和兔繁殖能力比普通级低 代谢和营养无菌动物血中含氮量少，肠管对水的吸收率低， 代谢周期比普通动物长体内不能合成维生素B和K，易产生这两种维生素 的缺乏症 抗辐射能力无菌动物抗辐射能力强，抗实验性烫伤和抗休克 死亡能力也强于普通动物 寿命无菌动物的寿命普遍长于普通动物二、悉生动物（Gnotobiotic animal，简称 GN） 定义：又称已知菌动物，指动物体内带有明 确的微生物种类的动物。
饲养条件：无菌隔离器内 来源：人为将已知的微生物投给无菌动物， 使其体内带有已知菌单菌动物双菌动物多菌动物悉生动物的培育 （1）获取无菌动物 （2）准备好特定的微生物材料 （3）把上述材料转入无菌饲育隔离器 （4）在隔离器内给无菌动物授入微生物悉生动物特点： 微生物特点 体内携带有已知微生物 来源 无菌动物植入微生物 饲养管理必须饲养在温湿度恒定的百级空气净化的隔离系统 中，实行严格的微生物控制 其他与无菌动物比较悉生动物肠道内存在细菌可以合成维生素，不会像无菌动物一样发生维生素缺乏症抵抗力、生活力较强，易于饲养管理无菌动物和悉生动物的应用 1、病因学的研究 如：猫瘟、龋齿的形成 2、微生物学中的研究(1)微生物间的拮抗作用(2)微生物和宿主之间关系(3)病毒学研究 3、免疫学研究中的应用无菌动物体内既无抗原也无特异性抗体，处。