叶绿素 a,b 含量测定［实验目的］熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm,叶绿素b的最大吸 收峰在645nm吸收曲线彼此又有重叠根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD］ = Ca ・ ka1+Cb ・ kb1 (1)OD =Ca ・ ka+Cb ・ kb (2)2 2 2Ca为组分a的浓度(g/L) Cb为组分b的浓度(g/L)OD］为在波长入］(即组分a的最大吸收峰波长)时，混合液的光密度OD值OD2为在波长入2(即组分b的最大吸收缝波长)时，混合液的光密度OD值ka1，kb］, ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a (b)的浓度为(lg/L)时，其在相应波长(入1，入2)时 的光密度OD值叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表：波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式(1), (2)并整理的：Ca=0.0127OD -0.00269OD663 645Cb=0.0229OD -0.00468OD645 663若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：Ca=12.7OD663-2.69OD645 (3)Cb=22.9OD645-4.68OD663 (4)Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645 (5)Ct 为叶绿素总浓度，单位为 g/L。
利用(3), (4)，(5)式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度(g/L)［器材与试剂］1. 实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管2. 实验试剂：丙酮，碳酸钙3. 实验材料：植物叶片［实验步骤］1•色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5G放入研钵中加纯丙酮5ML,少许碳酸钙和石英砂， 研磨成匀浆，再加80%丙酮5ML,将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清 液用80%丙酮定容至20ML2•测定光密度：取上述色素提取液1ml,加80%丙酮4ml稀释和转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm, 645nm 处的光密度值3•按公式分别计算色素提取液中叶绿素A, B及叶绿素总浓度再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量 ［注意事项］1. 由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似 80%2. 由于叶绿素A, B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高 级型分光光度计［实验作业］1. 试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素A和叶绿素B的比值有无不同。
2. 分光光度法和比色法有何不同？3. 叶绿素A和叶绿素B在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素A和叶绿素B 的定量分析，为什么？。