目目 录录生物化学与分子生物学八年制课件29Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope有生命必有希望有生命必有希望 目目 录录目目 录录F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础F第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断F第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断F第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断F第五节第五节 基因基因诊诊断在法医学上的断在法医学上的应应用用 F第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 本章内容提要本章内容提要 目目 录录目目 录录第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics 目目 录录目目 录录基因诊断之父基因诊断之父—简悦威简悦威 1976年年加加州州大大学学华华裔裔科科学学家家 Kan YW用用核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术首首次次对对一一例例α地地中中海海贫贫血进行诊断血进行诊断 目目 录录目目 录录一、一、基因基因诊诊断的概念、特点及断的概念、特点及临临床意床意义义 定义：定义： 利利用用分分子子生生物物学学技技术术，，通通过过检检测测基基因因及及基基因因表表达达产产物物的的存存在在状状态态，，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊断断的的方方法法。
基基因因诊诊断断检检测测的的目目标标分分子子是是DNADNA、、RNARNA，也可以是蛋白质或者多肽也可以是蛋白质或者多肽 目目 录录目目 录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、、RNA或或蛋蛋白白质质水水平平变变化化，，如如病病毒毒基基因因及及其其转转录录产产物物在在体体内内从从无无到到有有、、癌癌基基因因表表达达水水平平从低到高；从低到高；l基基因因结结构构变变化化，，如如点点突突变变引引起起基基因因失失活活、、染染色色体转位引起基因异常激活或灭活体转位引起基因异常激活或灭活 目目 录录目目 录录基因诊断的特点基因诊断的特点ü高特异性高特异性ü高灵敏性高灵敏性ü早期诊断性早期诊断性ü应用广泛性应用广泛性 目目 录录目目 录录二、基因诊断中常用的分子生物学技术二、基因诊断中常用的分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）） n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）） n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）） nDNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）） n生物芯片（生物芯片（biochips）） nWestern免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）） n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断 目目 录录目目 录录（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。
新配对形成双链的过程 目目 录录目目 录录核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交去除未杂交的探针去除未杂交的探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标记探针标记加入标记探针加入标记探针 目目 录录目目 录录 提提取取DNA→限限制制性性内内切切酶酶消消化化DNA以以产产生生特特定定长长度度的的片片段段→凝凝胶胶电电泳泳分分离离 →变变性性处处理理→DNA转转印印到到膜膜上上并并使使其其牢牢固固结结合合→将将标标记记的的探探针针与与膜膜上上DNA片片段段杂杂交交，，分分析析杂杂交交信信号1. Southern 印迹杂交印迹杂交(Southern blotting) 目目 录录目目 录录 RNA经经变变性性琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳后后，，转转移移到到固固相相支支持持物物上上，，通通过过分分子子杂杂交交检检测测特特定定的的mRNA分子的含量与大小分子的含量与大小2. Northern印迹杂交印迹杂交(Northern blotting) 目目 录录目目 录录3. 斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）） 将将RNA或或DNA变变性性后后直直接接点点样样于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，，用用于于基基因因组组中中特特定定基基因因及其表达产物的定性及定量的研究。
及其表达产物的定性及定量的研究 目目 录录目目 录录 4. 反向斑点杂交反向斑点杂交（（reverse dot blotting）） 先先将将探探针针固固定定于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，，将将样样品品RNA或或DNA标标记记变变性性后后进进行行杂杂交交改改变变了了传传统统杂杂交交方方法法中中一一次次杂杂交交只只能能检检测测一一种种样样品品的的局局限限，，大大大大提提高高了了基基因因诊断的效率诊断的效率 目目 录录目目 录录 寡寡核核苷苷酸酸中中的的碱碱基基错错配配会会大大大大影影响响杂杂交交分分子子的的稳稳定定性性，，可可用用人人工工合合成成的的针针对对正正常常和和突突变变ASO探探针针进进行行反反向向斑斑点点杂杂交交，，检检测测点点突突变变，，大大大提高检测结果的可靠性大提高检测结果的可靠性等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）） 目目 录录目目 录录5. 5. 原位分子杂交原位分子杂交n荧光原位杂交荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH））n挂锁挂锁FISH (FISH with padlock) 目目 录录目目 录录荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）） 目目 录录目目 录录 6. 固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwich hybridization) 待待测测靶靶基基因因序序列列上上两两个个相相邻邻但但不不重重叠叠的的DNA片片段段（（A、、B片片段段）），，分分别别作作为为捕捕捉捉探探针针（（不不标标记记的的A片片段段））和和检检测测探探针针（（标标记记的的B片片段段）），，同同时时与与靶靶基基因因杂杂交交。
先先将将捕捕捉捉探探针针吸吸附附于于固固相相支支持持物物上上，，与与靶靶基基因因序序列列A部部分分杂杂交交，，再再加加入入标标记记的的检检测测探探针针，，检测探针与靶基因序列检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号部分杂交，检测杂交信号 目目 录录目目 录录固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 目目 录录目目 录录（二）（二） 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR））模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火 目目 录录目目 录录PCR在基因诊断中的应用在基因诊断中的应用nRT-PCRRT-PCRn荧光定量荧光定量PCRPCRn多重多重-PCR-PCRnPCR-ASOPCR-ASOnAS-PCRAS-PCRnPCR-SSCPPCR-SSCPnPCR-RFLPPCR-RFLP 目目 录录目目 录录1. RT-PCR 目目 录录目目 录录2. 荧光定量荧光定量PCR荧光标记引物荧光标记引物 目目 录录目目 录录 3. 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；；B B：多重：多重PCRPCR 目目 录录目目 录录4. PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM 目目 录录目目 录录（三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析（（single-strand conformation polymorphism, SSCP）） DNA 的的突突变变造造成成DNA片片段段中中碱碱基基序序列列不不同同，，变变性性为为单单链链后后在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的构构象象不不同同（（单单链链构构象象多多态态性性）），，利利用用迁迁移移率率的的差别可使各种序列不同的单链分离开来。
差别可使各种序列不同的单链分离开来 目目 录录目目 录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意 目目 录录目目 录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+ + PCR-SSCP分析分析 －－ 目目 录录目目 录录 （四）限制性片段长度多态性分析（四）限制性片段长度多态性分析 （（restriction fragment length polymorphism, RFLP）） 由由于于DNA 变变异异产产生生新新的的酶酶切切位位点点或或原原有有的的酶酶切切位位点点消消失失，，在在用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化时时产产生生不不同同长度或不同数量的片段长度或不同数量的片段 可借助核酸分子杂交或可借助核酸分子杂交或PCR进行检测进行检测 目目 录录目目 录录 设设计计适适当当的的扩扩增增引引物物，，使使扩扩增增片片段段包包括括某某一一个个或或数数个个限限制制性性内内切切酶酶识识别别序序列列，，在在PCR扩扩增增后后用用该该限限制制酶酶切切割割PCR产产物物，，根根据据电电泳泳后后酶酶切片段长度变化，即可作出诊断。
切片段长度变化，即可作出诊断PCR-RFLP 目目 录录目目 录录ABCDEFG－－＋＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－－ ＋＋C +DAEcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化限制性内切酶位点的变化 目目 录录目目 录录（五）（五） DNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）） 目目 录录目目 录录DNA序列测定原理序列测定原理(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法) 目目 录录目目 录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究 目目 录录目目 录录（六）生物芯片（六）生物芯片（（biochips））n基因芯片（基因芯片（gene chips））n蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip) 目目 录录目目 录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图 目目 录录目目 录录基因诊断中常用的分子生物学方法比较基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法方法优点与问题优点与问题解决方案解决方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择合适的探针选择合适的探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计合适的引物设计合适的引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择合适的片段选择合适的片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择合适的限制酶选择合适的限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不适宜广泛使用可自动化，但不适宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛效率高，成本高，不适宜广泛使用使用选择合适的芯片选择合适的芯片 目目 录录目目 录录三、三、 基因诊断技术路线与方法基因诊断技术路线与方法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常达是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 根据对致病基因或相关基因的了解程度决根据对致病基因或相关基因的了解程度决定基因诊断的技术途径选择。
定基因诊断的技术途径选择 目目 录录目目 录录（一）直接诊断途径（一）直接诊断途径 必要条件：必要条件：◆ ◆ 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系◆ ◆ 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定◆ ◆ 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知已知 目目 录录目目 录录5/——5/—3/3/—RFLP1. 1.点突变的检测点突变的检测（（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变 目目 录录目目 录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、、PCR-SSCP、、 PCR-ASO、、PCR产物直接测序产物直接测序5/——5/—3/3/—（（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 目目 录录目目 录录 在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列的的重重新新排排布布包包括括数数十十个个碱碱基基到到数数千千个个碱碱基基的的丢丢失失、、插插入入、、替替换换、、重重复复和和倒倒位位等等，，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，，包包括括染染色色体体的的易易位位、、缺缺失失或或染染色色三三体体（（如如唐唐氏氏综综合合征）等。
征）等 2. 2. 基因重排的检测基因重排的检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 目目 录录目目 录录BamHIBamHIα2α1α2 10 kb14 kbprobe - -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断的直接基因诊断a- -珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同类型的不同类型的 - -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血 目目 录录目目 录录 根据引物根据引物3´3´端的互补与否，设计一对与正端的互补与否，设计一对与正常或突变模板配对的特异引物常或突变模板配对的特异引物等位基因特异等位基因特异PCR AS-PCR（（allele specific PCR）） 目目 录录目目 录录3. 基因表达异常的检测基因表达异常的检测 mRNA的相对定量分析的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析的绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析 目目 录录目目 录录（二）间接诊断途径（二）间接诊断途径1.1.采用原因采用原因①①致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定②②致病突变机制不清致病突变机制不清③③致病位点不便检测致病位点不便检测 目目 录录目目 录录 DNA多多态态性性：：指指群群体体中中的的DNA分分子子存存在在至至少少两两种种不不同同的的类类型型，，即即个个体体间间同同一一染染色色体体的的相相同同位位置置上上核核苷苷酸酸序序列列存存在在一一定定的的差差异异或变异。
或变异 多多在在进进化化中中形形成成，，本本身身并并不不致致病病，，只只是是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系与某些遗传性致病基因有一定连锁关系2. 2. 遗传标记遗传标记 目目 录录目目 录录间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记三代遗传标记：三代遗传标记：①① RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）②② VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats)③③ SNP(single nucleotide polymorphism) 目目 录录目目 录录7.6kb13kb患患者者正正常常 HBS的间接基因诊断的间接基因诊断 ——RFLP标记的连锁分析标记的连锁分析HapⅠⅠ7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针 目目 录录目目 录录 第二节第二节 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases 目目 录录目目 录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）） （一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病 （二）（二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 二、血友病（二、血友病（Hemophilia）） 甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断 三、脆性三、脆性X综合征综合征 目目 录录目目 录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断——ASO杂交法杂交法2.HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 目目 录录目目 录录n正常的（正常的（N）的）的ASO探针：探针： 5´-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3´ n突变的（突变的（M）的）的ASO探针：探针： 5´-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3´1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法 目目 录录目目 录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子 5´3´正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)×5´3´突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析MstⅡ酶切位点酶切位点（（CCTNAGG））2. HBS的限制性内切酶谱分析的限制性内切酶谱分析目目 录录 0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析目目 录录 目目 录录目目 录录3. HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的扩增产物经正常人的扩增产物经 MstMst Ⅱ Ⅱ消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细两个片段，而镰状细胞贫血症患者的胞贫血症患者的DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker 目目 录录目目 录录1. PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测突变的检测 M：：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段；未酶解片段； 2：：bA/ bA；； 3：：bA/ bT；； 4：：bT/ bT注：由于注：由于54 bp、、114 bp、、72 bp片段及分子量标准中低于片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到％的琼脂糖凝胶中不易被观察到（二）（二） - -珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症 目目 录录目目 录录 -珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析2. 2. 反向斑点杂交反向斑点杂交 目目 录录目目 录录二、血友病（二、血友病（Hemophilia））n甲甲 型型 血血 友友 病病 是是 由由 于于 血血 浆浆 凝凝 血血 因因 子子VIII（（FVIII）缺陷造成。
缺陷造成n甲甲型型血血友友病病的的基基因因突突变变类类型型已已有有300余余种种，，其其中中点点突突变变占占174种种；；另另有有部部分分患患者者是是由由于于缺失或插入突变或内含子缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致的基因倒位所致 目目 录录目目 录录1. FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印迹分析印迹分析 将将基基因因组组DNA用用Nco I，，Dra I或或Bcl I等等内内切切酶酶（（酶酶切切位位点点位位于于交交换换点点两两侧侧））消消化化，，用用特特异异探探针针进进行行杂杂交交分分析析，，正正常常人人表表现现为为21.5 kb、、14 kb和和16 kb三三种种类类型型I型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、、17.5和和14 kb三三种种类类型型；；Ⅱ型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、、16和和15.5 kb三三种种带带型型在在一一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现 目目 录录目目 录录2. FVIII基因突变的检测基因突变的检测（（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧的多态性标记基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析的连锁分析（（2））RFLP连锁分析连锁分析（（3））VNTR分析分析（（4）短串联重复序列（）短串联重复序列（STR）的连锁分析）的连锁分析 目目 录录目目 录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性 X 智力低下基因智力低下基因1（（FMR1））5ˊ非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定的定的(CGG)n 三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列的异常扩增以及相邻CpG 岛的异常甲基化。
岛的异常甲基化n正常人中约为正常人中约为 8～～50 拷贝n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52～～200拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG 岛岛未被甲基化，称为前突变（未被甲基化，称为前突变（premutation）n男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到200～～1000拷贝，相邻的拷贝，相邻的CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（full mutation） n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因的表达，基因的表达，FMR1 mRNA在在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状 目目 录录目目 录录脆性脆性X综合征常用基因诊断方法综合征常用基因诊断方法1．．PCR-ASO 2．．DNA连锁分析连锁分析 3．．Souhern印迹杂交法印迹杂交法4．．PCR扩增扩增 第三节第三节 传染病的基因诊断传染病的基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目 录录 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）） HAV系系RNA病病毒毒，，利利用用RT-PCR技技术术可可从从粪粪便便中检测出甲型肝炎病毒的基因组中检测出甲型肝炎病毒的基因组RNA。
n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）） 设设计计保保守守区区序序列列引引物物，，扩扩增增各各型型HBV DNA片片段段；；设设计计位位于于可可变变区区的的引引物物扩扩增增某某一一亚亚型型HBV DNA，以便分型以便分型n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）） HCV为为正正链链RNA病病毒毒，，先先反反转转录录成成cDNA，，再再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV 目目 录录 目目 录录目目 录录二、细菌引起的疾病二、细菌引起的疾病n结核分枝杆菌结核分枝杆菌 先先设设计计一一对对特特异异性性引引物物，，用用PCR技技术术扩扩增增出出一一383 bp序序列列，，再再用用探探针针杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平个细菌水平n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）） 主主要要采采用用PCR技技术术：：①①检检测测HP染染色色体体DNA特特异异片片段段；；②②检检测测HP尿尿素素酶酶A基因；基因；③③用用PCR-RFLP鉴别鉴别HP菌株 目目 录录目目 录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫 n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫n衣原体感染衣原体感染 诊断方法：核酸杂交和诊断方法：核酸杂交和PCR技术技术 目目 录录目目 录录第四节第四节 肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors 目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测 二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 目目 录录目目 录录一、原癌基因与抑癌基因的检测一、原癌基因与抑癌基因的检测1．原癌基因的检测．原癌基因的检测 ras 基基因因家家族族由由H-ras、、K-ras和和N-ras组组成成。
最最常常见见的突变是第的突变是第12、、13、、59或第或第61位密码子的点突变位密码子的点突变 胰胰腺腺癌癌、、结结肠肠癌癌、、肺肺癌癌以以K-ras突突变变为为主主，，如如第第12位位密密码码子子突突变变，，由由编编码码甘甘氨氨酸酸的的GGT突突变变为为TGT、、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT 急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主突变为主 目目 录录目目 录录 PCR 及及PCR-SSCP分分析析：：扩扩增增ras 基基因因第第12位位密密码码子子点点突突变变部部位位，，再再用用SSCP技技术术进进行行分分析析，，或或者者直直接接测测序序确确定定患患者者ras原原癌癌基基因因的的点点突突变 核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变位密码子点突变2. ras原癌基因突变常用的检测方法原癌基因突变常用的检测方法 目目 录录目目 录录3．抑癌基因．抑癌基因p53的检测的检测 np53基基因因以以密密码码子子第第175位位、、第第248位位、、第第249位位、、第第273位位及及 第第282位位点点突突变变率率最最高高。
在在结结直直肠肠癌癌、、乳乳腺腺癌癌、、小小细细胞胞肺肺癌癌，，都都可可见见异异常常的的p53基基因因蛋白np53的基因诊断方法有的基因诊断方法有 （（1））PCR-SSCP分析技术分析技术 （（2））DNA序列分析序列分析 （（3））PCR-RFLP分析分析 目目 录录目目 录录（一）乳腺癌（一）乳腺癌 1．乳腺癌常见基因变异．乳腺癌常见基因变异 5%～～10%乳乳腺腺癌癌患患者者有有家家族族遗遗传传性性乳乳腺腺癌癌高高危危家家族族中中常常有有抑抑癌癌基基因因的的BRCA基基因因（（breast cancer gene）的突变 BRAC1突突变变易易致致乳乳腺腺癌癌突突变变分分布布于于整整个个编编码码序序列列，，没没有有明明显显的的突突变变簇簇或或突突变变热热点点70%的的缺缺失失或或插插入入导导致致编编码码序序列列的的框框移移和和翻翻译译提提前前终终止止BRCA1在在N端端的的一一半半部部位位截截短短，，与与乳乳腺腺癌癌和和卵卵巢巢癌癌的的高高风风险险相相关关；；而而在在C端端截截短短则则主主要要与与乳乳腺腺癌癌高高危危有关。
有关 BRCA2基基因因在在30%～～40%的的散散发发性性乳乳腺腺癌癌有有杂杂合性缺失（合性缺失（LOH）突变提高乳腺癌易感性突变提高乳腺癌易感性二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 目目 录录目目 录录（（1））PCR法检测法检测BRCA1基因突变基因突变（（2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（FISH）检测）检测BRCA2基基因扩增因扩增2．乳腺癌基因诊断方法．乳腺癌基因诊断方法 目目 录录目目 录录（二）结肠癌（二）结肠癌 1.结肠癌常见基因变异结肠癌常见基因变异 在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变 APC（（adenomatous polyposis coli））是是结结肠肠癌癌发发生生过过程程中中第第一一个个突突变变基基因因K-ras原原癌癌基基因因突突变变也也是是结肠癌形成的早期事件结肠癌形成的早期事件 DCC（（deletion of colorectal cancer））基基因因失失活活是是 结结 肠肠 癌癌 发发 展展 的的 晚晚 期期 事事 件件 。
抑抑 癌癌 基基 因因 DPC4和和MADR2也可能会因也可能会因18q等位基因丢失而失活等位基因丢失而失活 p53基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象 DNA修修复复基基因因也也与与结结肠肠癌癌有有关关如如hMSH2、、hMLH1、、hPMS1或或hPMS2基基因因的的突突变变所所致致的的DNA错错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关二、常见肿瘤的基因诊断二、常见肿瘤的基因诊断 目目 录录目目 录录（（1））PCR-SSCP法：法：对腺瘤样息肉病人对腺瘤样息肉病人APC基基因因PCR-SSCP技术进行分析技术进行分析2）异源双链）异源双链PCR法：法：检测检测APC基因变异基因变异3）蛋白质免疫印迹法：）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩检测因基因突变而缩短了的短了的APC蛋白 2．结肠癌基因诊断方法．结肠癌基因诊断方法 第五节第五节 基因诊断在法医学上的应用基因诊断在法医学上的应用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目 录录 目目 录录目目 录录n重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。
群中存在变异，形成多态性n串联重复序列散在分布于染色体上串联重复序列散在分布于染色体上n重复单位重复单位6～～25 bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA重复单位重复单位2～～6 bp长，如（长，如（TA））n, (CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNA一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标记指纹与多态性遗传标记 目目 录录目目 录录 可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列(VNTR) 人人类类染染色色体体上上小小卫卫星星DNA的的高高度度可可变变区区（（ HVR）） 是是 由由 头头 尾尾 相相 连连 的的 串串 联联 重重 复复 序序 列列（（tandem repeat，，TR））组组成成，，TR的的核核心心序序列列同同源源性性很很高高，，等等位位HVR的的长长度度由由于于TR的的重重复复次数不同而有很大的差别，具高度多态性次数不同而有很大的差别，具高度多态性 目目 录录目目 录录 DNA长度多态除可用长度多态除可用Southern印迹杂交法印迹杂交法检测外，还可以通过检测外，还可以通过PCR扩增后电泳来检出扩增后电泳来检出。
扩增片段长度多态扩增片段长度多态（（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）） 1985年年，，英英国国遗遗传传学学家家Jeffeys等等人人用用TR的的核核心心序序列列为为探探针针进进行行RFLP分分析析时时，，检检测测到到许许多多HVR，，并并产产生生相相应应的的图图谱谱，，所所得得图图谱谱具具有有高高度度的的个个体体特特异异性性，，达达到到了了如如同同人人类类指指纹纹那那样样的的高高度度专专一一性性，，所所以以称称其其为为DNA指指纹纹图图谱谱（（DNA fingerprinting） Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 目目 录录 目目 录录目目 录录人类人类DNADNA指纹图指纹图 目目 录录目目 录录二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个个体体识识别别和和亲亲子子鉴鉴定定：： DNA指指纹纹技技术术是是从从基基因因水水平平检检测测DNA的的高高度度多多态态性性，，个个体体识识别别率高n以以往往在在刑刑事事案案件件的的法法医医学学鉴鉴定定中中应应用用的的是是血血型型、、血血清清蛋蛋白白型型、、红红细细胞胞酶酶型型和和HLA分分型型，，个个体体分分辨辨能能力力不不够够，，只只能能排排除除，，不不能能做做到到统统一认证。
一认证 目目 录录目目 录录法医案检中的基因诊断技术法医案检中的基因诊断技术nVNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）的小卫星）的核酸分子杂交分析核酸分子杂交分析nSTR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）的微卫星）的PCR分分析析nSNP的基因芯片检测的基因芯片检测 目目 录录目目 录录1．单位点探针检测及．单位点探针检测及PI值的计算值的计算 父父权权指指数数（（Paternity Index，，PI））值值、、父父权权相相对对指指数数或或亲亲子子关关系系概概率率值值计计算算方方法法基基本本一一致 PI值值表表示示争争议议父父作作为为亲亲父父比比随随机机男男人人作作为为亲亲父父的的可可能能性性大大多多少少倍倍，，PI值值大大于于1表表示示倾倾向向肯肯定定父父子子关关系系，，数数值值越越大大，，可可能能性性越越大大；；等等于于0时表示排除父子关系时表示排除父子关系 目目 录录目目 录录 2．．DNA指纹图与亲权鉴定指纹图与亲权鉴定 多多位位点点VNTR系系统统和和DNA指指纹纹图图的的电电泳泳分分离离后后片片段段数数目目较较多多，，各各等等位位基基因因频频率率分分布布的的计计算算复复杂杂，，进进行行亲亲权权鉴鉴定定和和个个体体识识别别时时匹匹配配概概率率的的计计算算影影响响因因素素较较多多，，目目前前尚无一个公认的最合理的计算方法。
尚无一个公认的最合理的计算方法 目目前前解解决决亲亲权权纠纠纷纷最最简简单单的的办办法法是是先先在在孩孩子子DNA指指纹纹图图中中找找出出非非母母片片段段并并计计数数为为P，，然然后后分分析析争争议议父父DNA指指纹纹图图，，看看P条条非非母母带在争议父中出现多少条带在争议父中出现多少条 目目 录录目目 录录亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女 第六节第六节 基因治疗的概念及策略基因治疗的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目目 录录 n基因治疗：基因治疗：指将目的基因通过基因转移指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导的基因转移技术）导入靶细胞内，目导的基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表达产物对疾病起治疗作用的基因表达产物对疾病起治疗作用 目目 录录 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部主细胞内的基因发生整合、成为宿主基因组的一部分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用。
分，目的基因表达产物起治疗疾病的作用 广义基因治疗：广义基因治疗： ①①外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质； ② ②采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因； ③ ③将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物； ④ ④向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的疗疾病的目的目目 录录 本节内容提要本节内容提要 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略二、基因转移技术二、基因转移技术三、基因干预三、基因干预四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究五、基因治疗的前景与问题五、基因治疗的前景与问题目目 录录 目目 录录基因治疗分类基因治疗分类Ø体细胞体细胞(somatic cell)基基因治疗因治疗Ø生殖细胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代 目目 录录目目 录录 一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略 目目 录录 （一）基因置换（一）基因置换（（gene replacement）） 定定义义：：指指将将特特定定的的目目的的基基因因导导入入特特定定细细胞胞，，通通过过定定位位重重组组，，导导入入的的正正常常基基因因，，以以置置换换基基因因组组内内原原有的缺陷基因。
有的缺陷基因 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正将缺陷基因的异常序列进行桥正 对对缺缺陷陷基基因因的的缺缺陷陷部部位位进进行行精精确确的的原原位位修修复复，，不涉及基因组的任何改变不涉及基因组的任何改变 目目 录录n定定向向整整合合的的条条件件:转转导导基基因因的的载载体体与与基基因因组组DNA具具有有相相同同的的序序列列带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，，进进行行部部分分基基因因序序列的交换列的交换n基基因因同同源源重重组组技技术术又又称称为为基基因因打打靶靶(gene targeting））n细胞内基因同源重组的发生率很低细胞内基因同源重组的发生率很低基因同源重组技术基因同源重组技术 目目 录录（二）（二） 基因添加基因添加（（gene augmentation）） 定定义义: : 通通过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表达达其其本本身身 不表达的基因不表达的基因类型类型: :n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因，，而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去，，通通过过导导入入正正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因，，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
利用其表达产物达到治疗疾病的目的 目目 录录（三）基因干预（三）基因干预（（gene interference）） 定义：定义： 采采用用特特定定的的方方式式抑抑制制某某个个基基因因的的表表达达，，或或者者通通过过破破坏坏某某个个基基因因的的结结构构而而使使之之不不能能表表达，以达到治疗疾病的目的达，以达到治疗疾病的目的 目目 录录n定定义义：：将将““自自杀杀””基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生““自自杀杀””效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 目目 录录目目 录录自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 目目 录录☻TK/GCV 单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒（（herps simplex virus, HSV））Ⅰ型型胸胸苷苷激激酶酶（（thymidine kinase, tk））基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶，，特特异异性性地地将将无无毒毒的的核核苷苷类类似似物物丙丙氧氧鸟鸟苷苷（（ganciclovir, GCV））转转变变成成毒毒性性GCV三三磷磷酸酸核核苷苷，，后后者者能能抑抑制制DNA聚聚合合酶酶活活性，导致细胞死亡。
性，导致细胞死亡1.自杀基因系统自杀基因系统 目目 录录 定义定义: “自自杀杀基基因因”导导入入后后，，不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，，而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞也被杀死胞也被杀死 2. 旁观者效应（旁观者效应（bystander effect）） 目目 录录 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应抗癌免疫反应 目目 录录二、基因转移技术二、基因转移技术 基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞目目 录录 目目 录录 基因转移基因转移(gene transfer)技术技术 1.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 目目 录录 1. 1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病病毒毒载载体体介介导导的的基基因因转转移移效效率率较较高高，，因因此此它它也也是是使使用用最最多多的的基基因因治治疗疗载载体体。
据据统统计计，，有有72%72%的的临临床床实实验验计计划划和和71%71%的的病病例例使使用用了了病病毒毒载载体体，，其其中中用用得得最最多多的的是是反反转转录录病病毒毒载载体体 目目 录录反转录病毒的结构及生活周期反转录病毒的结构及生活周期（（1 1）反转录病毒）反转录病毒 目目 录录p两端各有一长末端重复序列两端各有一长末端重复序列LTR 反转录病毒前病毒的结构特点反转录病毒前病毒的结构特点 pLTR由由U3、、R和和U5三部分组成三部分组成p病毒有三个结构基因病毒有三个结构基因p5ˊ端端LTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的序序列列（（ψ））及及剪剪接接供体位点供体位点(SD)和剪接受体位点和剪接受体位点(SA) p含含有有负负链链DNA转转录录的的引引物物结结合合位位点点(PBS)和和正正链链DNA转转录录的引物结合位点的引物结合位点l在在U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子； l U3和和U5两端分别有病毒整合序列两端分别有病毒整合序列(IS) ；；l 在在R内还有内还有poly(A)加尾信号加尾信号 lgag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；lpol基因，编码反转录酶；基因，编码反转录酶；lenv基基因因，，编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。
目目 录录反转录病毒介导的基因转移系统反转录病毒介导的基因转移系统 ——由两部分组成由两部分组成反反转转录录病病毒毒载载体体：：其其基基因因组组为为缺缺陷陷型型，，保保留留了了病病毒毒的的包包装装信信号号ψ，，而而缺缺失失病病毒毒的的包包装装蛋蛋白白基基因因；；它它可可以以克克隆隆并并表表达达外外源源治治疗疗基基因因，，但但不不能能自自我我包包装装成成有有增殖能力的病毒颗粒增殖能力的病毒颗粒 辅辅助助细细胞胞株株(如如PA317)：：由由另另一一种种缺缺陷陷型型反反转转录录病病毒毒（（即即带带有有全全套套病病毒毒包包装装蛋蛋白白基基因因，，但但缺缺失失包包装装信信号号ψ的的反反转转录录病病毒毒））感感染染构构建建而而成成能能合合成成包包装装蛋蛋白白，，用用于于反反转转录录病病毒毒载载体体包包装装，，但但本本身身却却不不能能包包装成辅助病毒颗粒装成辅助病毒颗粒 目目 录录目目 录录Retroviral packaging system 目目 录录 反转录病毒载体的特点反转录病毒载体的特点 ①①反反转转录录病病毒毒包包膜膜上上env编编码码的的糖糖蛋蛋白白，，能能够够被被许许多多哺哺乳乳动动物物细细胞胞膜膜上上的的特特异异性性受受体体识识别别，，从从而而使使反反转转录录病病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。
毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞 ②②反反转转录录病病毒毒结结构构基基因因gag、、env和和pol的的缺缺失失不不影影响响其其他部分的活性他部分的活性 ③③前前病病毒毒通通过过LTR高高效效整整合合至至靶靶细细胞胞基基因因组组中中，，有有利利于于外源基因在靶细胞中的永久表达外源基因在靶细胞中的永久表达 ④④包包装装好好的的假假病病毒毒颗颗粒粒（（携携带带目目的的基基因因的的重重组组反反转转录录病病毒毒载载体体））以以出出芽芽的的方方式式分分泌泌至至辅辅助助细细胞胞培培养养的的上上清清液液中，易于分离制备中，易于分离制备 目目 录录 反转录病毒载体的主要缺点反转录病毒载体的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；在危险； 反转录病毒载体的容量较小，只能容纳反转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因以下的外源基因 目目 录录 （（2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体 腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36 kb)双双链链无无包包膜膜DNA病病毒毒。
它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，，保保持持在在染染色色体体外外，，不整合进入宿主细胞基因组中不整合进入宿主细胞基因组中 腺腺病病毒毒是是人人类类呼呼吸吸道道感感染染的的病病原原体体，，但但目目前前尚尚未未发发现现与与肿肿瘤瘤发发生生有有关关联联宿宿主主细细胞胞范范围围广广，，可可感感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等 目目 录录 目目 录录腺病毒的优点腺病毒的优点l基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；l宿主范围广；宿主范围广；l基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；l重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；或气管内滴注；l腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因外源基因目目 录录 目目 录录 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点l宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂l有两个环节可能产生复制型腺病毒。
有两个环节可能产生复制型腺病毒l靶向性差靶向性差 l不不能能整整合合到到靶靶细细胞胞的的基基因因组组DNA中中分分裂裂增增殖殖 快快的的细细胞胞，，导导入入的的重重组组病病毒毒载载体体，，随随分分裂裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短而丢失的机会增多，表达时间相对较短 目目 录录（（3）腺病毒相关病毒载体）腺病毒相关病毒载体 一类单链线状一类单链线状DNA缺陷型病毒其基缺陷型病毒其基因组因组DNA小于小于5 kb，，无包膜，外形为裸露无包膜，外形为裸露的的20面体颗粒面体颗粒AAV不能独立复制，只有不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染否则只能建立溶源性潜伏感染AAV Virus Particles 目目 录录目目 录录Structure of AAV Virus Genomic DNAREP：病毒复制基因：病毒复制基因, CAP：编码衣壳蛋白的基因：编码衣壳蛋白的基因ITR：反向末端重复序列：反向末端重复序列 目目 录录目目 录录AAV的特点的特点l以潜伏感染为主；以潜伏感染为主；l病毒基因组与细胞共存；病毒基因组与细胞共存；l只要宿主细胞正常，只要宿主细胞正常，AAV基因表达被抑基因表达被抑制而维持潜伏状态；制而维持潜伏状态；l若细胞受刺激，表达应激基因，若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基基因表达从而使因表达从而使AAV病毒复制；病毒复制；l产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。
建立新的潜伏状态 AAV载载体体是是目目前前正正在在研研究究的的一一类类新新型型安安全全载体，它对人类无致病性载体，它对人类无致病性 AAV可可以以高高效效定定点点整整合合至至人人19号号染染色色体体的的特特定定区区域域19q13.4中中，，并并能能较较稳稳定定地地存存在在这这种种靶靶向向定定点点整整合合可可以以避避免免随随机机整整合合可可能能带带来来的的抑抑癌癌基基因因失失活活和和原原癌癌基基因因激激活活的的潜潜在在危危险险性性，，而而且且外外源源基基因因可可以以持持续续稳稳定定表表达达，，并并可可受受到到周周围围基基因因的的调调控控，，兼兼具具反反转转录录病病毒毒载载体体和和腺腺病病毒毒载载体体两两者者的的优点 目目 录录 目目 录录 AAV载体的缺陷载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容载体容量小，目前最多只能容纳纳5 kb外源外源DNA片段；片段；感染效率比反转录病毒载体低感染效率比反转录病毒载体低,在在40%~80%的成人中存在过感染的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥可能会引起免疫排斥 目目 录录目目 录录常用基因治疗载体常用基因治疗载体 整合整合致病性致病性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量反反 转转 录录 病病 毒毒 载体载体随随机机整整合合，，效效率高率高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞<7kb<7kb腺病毒载体腺病毒载体不不整整合合，，可可能能丢失丢失不致病不致病分分裂裂细细胞胞、、非非分裂细胞分裂细胞 腺腺相相关关病病毒毒载载体体定定点点整整合合( (1919号号染色体特定区域染色体特定区域) )不致病不致病分分裂裂细细胞胞、、非非分裂细胞分裂细胞<5kb<5kb<7.5kb<7.5kb 目目 录录 2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系统 （（1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂脂质质体体介介导导的的基基因因转转移移技技术术使使用用方方便便、、成成本本低廉。
低廉 基基本本原原理理:利利用用阳阳离离子子脂脂质质体体单单体体与与DNA混混合合后后，，可可以以自自动动形形成成包包埋埋外外源源DNA的的脂脂质质体体，，然然后后与与细细胞胞一一起起孵孵育育，，即即可可通通过过细细胞胞内内吞吞作作用用将将外外源源DNA（（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达即目的基因）转移至细胞内，并进行表达 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图目目 录录 目目 录录 （（2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的的配配体体偶偶联联，，可可使使DNA具具有有靶靶向向性性这这种种偶偶联联通通常常通通过过多多聚聚阳阳离离子子（（如如多多聚聚赖赖氨氨酸酸））来来实实现现多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，，又又通通过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷的的DNA结结合合，，将将DNA包包围围，，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面这这样样形形成成的的复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体的的靶靶细细胞胞吞吞饮饮，，从从而而将将外外源源DNA导入靶细胞。
导入靶细胞 受体介导转移技术示意图受体介导转移技术示意图目目 录录 目目 录录 （（3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不不需需要要进进行行基基因因工工程程的的繁繁琐琐操操作作，，直直接接将将裸裸露露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内注入动物肌肉或某些器官组织内 动动物物实实验验表表明明：：接接受受注注射射外外源源DNA的的小小鼠鼠能能够够按按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久 n将将促促进进心心脏脏血血管管生生长长的的基基因因直直接接注注入入实实验验鼠鼠的的心心脏脏，，可可使使其其心脏壁内毛细血管增加心脏壁内毛细血管增加30%～～40%；；n将将胰胰岛岛素素基基因因直直接接注注入入鼠鼠骨骨骼骼肌肌细细胞胞，，能能分分泌泌糖糖尿尿病病所所缺缺少少的胰岛素；的胰岛素；n肌肌内内注注射射凝凝血血因因子子Ⅸ基基因因，，可可产产生生血血友友病病所所需需的的凝凝血血因因子子Ⅸ 目目 录录 基因直接注射法的优点基因直接注射法的优点p制制备备具具有有调调控控部部件件的的质质粒粒DNA重重组组体体的的技技术术较较容容易；易；p排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；p导导入入的的基基因因不不需需整整合合即即可可表表达达，，避避免免了了反反转转录录病病毒毒载载体体导导入入整整合合后后，，一一旦旦发发生生副副作作用用不不易易中中止止或或逆转的缺点；逆转的缺点；p基基因因直直接接注注射射法法可可反反复复使使用用，，而而病病毒毒载载体体则则可可能能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。
诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降 目目 录录三、基因干预三、基因干预 （（gene interference）） 目目 录录（一）反义（一）反义RNA（（antisense RNA）） 1. 反义反义RNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种： （（1）体外合成反义）体外合成反义RNA，，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用后，发挥作用 （（2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用而发挥作用 目目 录录 反义反义RNA的关键技术问题的关键技术问题☻反义反义RNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题☻专一性转移问题专一性转移问题 目目 录录2.受体介导反义受体介导反义RNA技转移术技转移术 ①①受体介导的受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；②②被被转转移移的的RNA是是被被保保护护的的，，与与周周围围环环境境之之间间存存在在多多聚聚赖赖氨氨酸酸的的保保护护层层, 可可以以抵抵抗抗环环境境中中的的核酸酶的降解作用。
核酸酶的降解作用 借助前述的受体介导基因转移方法借助前述的受体介导基因转移方法，，可可以实现受体介导的反义以实现受体介导的反义RNA转移 目目 录录 3. 反义反义RNA的优点的优点 受受体体介介导导的的反反义义RNA基基因因治治疗疗有有其其自自身身的的优优点点，，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足而在一定程度上补充了转基因治疗的不足 （（l）安全性高）安全性高 （（2）反义）反义RNA设计和制备方便设计和制备方便 （（3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （（4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNA病毒病毒 目目 录录（二）核酶（二）核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我分子，具有自我剪切作用但核酶也可以由两个剪切作用但核酶也可以由两个RNA分子组成分子组成 在在基基因因治治疗疗时时，，利利用用核核酶酶分分子子结结合合到到靶靶RNA分分子子中中适适当当的的部部位位，，形形成成锤锤头头状状核核酶酶结结构构，，将将靶靶RNA分分子子切切断断，，通通过过破破坏坏靶靶RNA分分子子而而达达到治疗疾病的目的。
到治疗疾病的目的 核酶锤头状的二级、三级结构核酶锤头状的二级、三级结构 只只要要两两个个RNA分分子子通通过过互互补补序序列列相相结结合合，，形形成成锤锤头头状状的的二二级级结结构构（（3个个螺螺旋旋区区）），，并并能能组组成成核核酶酶的的核核心心序序列列（（13个个或或11个个保保守守核核苷苷酸酸序序列列）），，就就可可在在锤锤头头右右上方产生剪切反应上方产生剪切反应目目 录录 目目 录录 1.核酶的设计核酶的设计 核核酶酶是是通通过过靶靶RNA分分子子与与核核酶酶分分子子共共同同组组成成酶酶活活性性结结构构域域，，要要从从靶靶分分子子和和核核酶酶分分子子两两个个方方面面来来设设计计核核酶 （1 1））选选择择合合适适的的靶靶部部位位，，该该部部位位具具有有核核酶酶切切割割位位点点，，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域能与核酶分子结合并组成酶活性结构域 （2））核核酶酶的的基基本本组组成成：：用用于于基基因因治治疗疗的的核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，，中中间间是是保保守守序序列列（（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构域），两端是引导序列构域），两端是引导序列。
目目 录录目目 录录核酶的作用机制核酶的作用机制 目目 录录 2.核酶的应用核酶的应用 与与一一般般的的反反义义RNA相相比比，，核核酶酶具具有有较较稳稳定定的的空空间间结结构构，，不不易易受受到到RNA酶酶的的攻攻击击更更重重要要的的是是，，核核酶酶在在切切断断mRNA后后，，又又可可从从杂杂交交链链上上解解脱脱下下来来，，重重新结合和切割其它的新结合和切割其它的mRNA分子 目目 录录（三）干扰（三）干扰RNA 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干干扰扰（（RNA interference，， RNAi））是是一一种种由由双双链链RNA诱诱发发的的基基因因沉沉默默现现象象在在此此过过程程中中，，与与双双链链RNA有有同同源源序序列列的的信信使使RNA（（mRNA））被被降降解解，，从从而而抑抑制制该该基基因因的的表表达达有有义义RNA（（sense RNA））或或反反义义RNA（（antisense RNA））均均能能抑抑制制线线虫虫基基因因的的表表达达，，双双链链RNA比比单单链链RNA更更为为有有效效这这与与传传统统上上对对反反义义RNA技技术术的的解解释释正正好好相相反反。
而而且且其其抑抑制制基基因因表表达达的的效率比反义效率比反义RNA至少高至少高2个数量级个数量级 目目 录录 2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNA干扰过程主要有干扰过程主要有2个步骤：个步骤： （（1）小干扰性）小干扰性RNA（（siRNA））（（2））siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC) 该复合体可识别与该复合体可识别与siRNA有同源序列的有同源序列的mRNA，，并在特异的位点将该并在特异的位点将该mRNA切断切断 长双链长双链RNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNA特异性核酸特异性核酸酶酶Dicer切成切成21~23个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNA，，称为小干扰性称为小干扰性RNA（（small interfering RNA，，siRNA）） 目目 录录目目 录录RNA干扰机制示意图干扰机制示意图 目目 录录研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 由于由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。
的研究工具 RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段间可以控制在发育的任何阶段 目目 录录1. 体外化学合成体外化学合成; 2.用用质质粒粒载载体体或或病病毒毒载载体体可可在在细细胞胞内内稳定地生成稳定地生成siRNA的产生的产生 目目 录录目目 录录四、基因治疗的应用研究四、基因治疗的应用研究 目目 录录（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 ( (一一) )遗传病基因治疗必须符合以下要求遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在在DNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因的表达不需要精确调控；该基因的表达不需要精确调控；4.该该基基因因能能在在一一种种便便于于临临床床操操作作的的组组织织细细胞胞中中表表达并发挥其生理作用；达并发挥其生理作用；5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严重重后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。
可可供供选选择择并并符符合合上上述述4条条以以上上要要求求的的不过只有不过只有30余种遗传病余种遗传病 n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症缺乏症 n珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 n血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 n苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 n莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)综合征综合征 n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 n囊性纤维化病囊性纤维化病 目 录 目目 录录（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （（1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制癌症的发生、发展和转移； 肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生会导致肿瘤的发生2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；溶解和排斥反应；（（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。
杀伤癌细胞 目目 录录 肿瘤基因治疗的常用方法肿瘤基因治疗的常用方法 ☻基基因因干干预预技技术术：：通通过过基基因因干干预预，，抑抑制制肿肿瘤瘤细细胞胞中中过过度表达的癌基因，从而降低其恶性表型度表达的癌基因，从而降低其恶性表型☻自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞自杀基因治疗：直接杀死肿瘤细胞☻肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提肿瘤的免疫基因治疗：激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能高免疫效应细胞功能☻提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗： 药物增敏基因治疗；药物增敏基因治疗； 耐药基因治疗耐药基因治疗 目目 录录自杀基因治疗自杀基因治疗 基基本本原原理理：：向向肿肿瘤瘤细细胞胞内内导导入入某某些些真真核核细细胞胞中中不不存存在在的的酶酶基基因因（（自自杀杀基基因因）），，这这些些基基因因表表达达的的特特异异性性酶酶可可以以催催化化对对真真核核细细胞胞无无毒毒或或低低毒毒的的药药物物前前体体，，转转变变为为具具有有抑抑制制核核酸酸合合成成效效应应的的抗抗代代谢谢药药物物，，进进而而选选择择性性地地使使转转染了染了“自杀基因自杀基因”的肿瘤细胞的肿瘤细胞“自杀自杀”。
自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一中的研究热点之一 目目 录录 肿瘤的免疫基因治疗肿瘤的免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法细胞功能为目的的一种肿瘤基因治疗方法 主要包括：主要包括： 细胞因子（或受体）基因治疗；细胞因子（或受体）基因治疗； 抗原抗体基因治疗抗原抗体基因治疗 目目 录录 临临床床上上对对肿肿瘤瘤患患者者进进行行化化疗疗时时，，通通常常面面临临两两大难题：大难题：（（1））患患者者机机体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞对对化化疗疗药药物物的的敏敏感感程程度度存存在在差差异异，，特特别别是是某某些些经经过过多多次次化化疗疗的的患患者者，，其其体体内内的的肿肿瘤瘤细细胞胞已已经经产产生生了了多多药药耐耐药药性性，，对对多多种种化化疗疗药药物物产生交叉耐受，最终导致化疗失败产生交叉耐受，最终导致化疗失败2））大大剂剂量量的的化化疗疗可可能能导导致致患患者者的的正正常常细细胞胞，，特特别别是是骨骨髓造血细胞的功能受到抑制。
髓造血细胞的功能受到抑制 目目 录录 药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗： 为为了了使使化化疗疗药药物物能能够够最最大大程程度度地地杀杀死死肿肿瘤瘤细细胞胞，，可可以以将将某某些些药药物物增增敏敏基基因因导导入入肿肿瘤瘤细细胞胞，，特特别别是是对对化化疗疗药药物物原原本本不不敏敏感感的的肿肿瘤瘤细细胞胞，，使使其其对对抗抗肿肿瘤瘤药药物物的的敏敏感感性性大大大大增增加加，，从从而而达达到到增增强强化化疗疗效效果果的目的 提高化疗效果的辅助基因治疗提高化疗效果的辅助基因治疗 目目 录录 耐药基因治疗：耐药基因治疗： 肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶：肿瘤细胞耐药性与多种糖蛋白或酶： 多多药药耐耐药药（（mdr-1））基基因因编编码码的的P-糖糖蛋蛋白白、、多多药药耐耐药相关蛋白（药相关蛋白（MRP））以及肺耐药相关蛋白等；以及肺耐药相关蛋白等； 细胞内氧化和解毒作用的酶系统：细胞内氧化和解毒作用的酶系统： 细细胞胞色色素素P-450（（cytochrome P-450））、、谷谷胱胱甘甘肽肽S-转转移移酶酶（（GST））以以及及谷谷胱胱甘甘肽肽过过氧氧化化物物酶酶（（GSH-PX））等。
等 向向肿肿瘤瘤患患者者的的骨骨髓髓细细胞胞导导入入某某种种耐耐药药基基因因，，增增强强骨骨髓髓细细胞胞的的抗抗药药性性，，以以便便耐耐受受大大剂剂量量的的化化疗疗药药物物，，达达到到彻彻底杀灭肿瘤细胞的目的底杀灭肿瘤细胞的目的 目目 录录（三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒性疾病的基因治疗研究 据据统统计计，，75%75%的的人人类类传传染染病病是是由由病病毒毒引引起起的的病病毒毒感感染染人人体体后后不不仅仅可可能能急急性性发发病病，，还还可可以以在在人人体体内内长长期期潜潜伏伏，，造造成成终终身身伤伤害害病病毒毒还还是是造造成成先先天天畸畸形形的的重重要要因因素素之之一一它它与与某某些些癌癌症症、、自自身身免免疫疫性性疾疾病病和和内内分分泌泌疾疾病病也也存在一定的关联存在一定的关联 临临床床上上对对绝绝大大多多数数病病毒毒感感染染性性疾疾病病仍仍然然缺缺乏乏有有效效的的治治疗疗手手段段，，在在众众多多开开展展的的抗抗病病毒毒治治疗疗方方案案中中，，抗抗病病毒毒基基因治疗十分引人注目。
因治疗十分引人注目 目目 录录 1 1．调节机体免疫应答．调节机体免疫应答 （（1 1））将将细细胞胞因因子子( (如如干干扰扰素素、、白白细细胞胞介介素素等等) )的的基基因因，，导导入入机机体体免免疫疫细细胞胞，，激激活活免免疫疫细细胞胞并并促促进进其其增增殖殖分分化化，，增增强强机机体体的的细细胞胞和和体体液液免免疫疫应应答答，，促促进进机机体体清清除除病病毒毒感感染染的的细胞和游离病毒细胞和游离病毒 （（2 2））将将能能够够诱诱导导机机体体产产生生保保护护性性免免疫疫应应答答的的病病毒毒抗抗原原基基因因，，如如乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒表表面面抗抗原原基基因因等等，，导导入入机机体体，，表表达达的的抗抗原原不不仅仅可可以以诱诱导导机机体体产产生生保保护护性性抗抗体体，，还还可可以以引引发发特特异异性性的的细细胞胞免免疫疫应应答答，，产产生生对对野野生生型型致致病病病病毒毒攻攻击击的的防防御御作用 目目 录录2 2. .抗抗病病毒毒复复制制：：根根据据病病毒毒在在机机体体细细胞胞中中复制周期的各个环节来设计的复制周期的各个环节来设计的（（1 1））抑抑制制病病毒毒与与宿宿主主细细胞胞结结合合：：即即阻阻断断病病毒毒表表面面抗抗原原决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合。
决定簇与宿主细胞受体间的特异性结合 （（2 2）干扰病毒基因组的转录起始和调控干扰病毒基因组的转录起始和调控 （（3 3）抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成抑制病毒基因组的复制和蛋白质合成 （（4））RNA干扰技术干扰技术 （（5 5））将将抗抗病病毒毒蛋蛋白白质质基基因因，，如如2 2'→5''→5'腺腺苷苷酸酸合合成成酶酶等等基基因因，，导导入入细细胞胞并并持持续续表表达达，，可可以以激激活活核核酸酸酶酶F F，，降降解病毒解病毒RNARNA主要包括：主要包括： 目目 录录目目 录录 五、基因治疗的问题与展望五、基因治疗的问题与展望n 治疗基因调控元件的选择治疗基因调控元件的选择n 安全高效载体的构建和转移技术的选择安全高效载体的构建和转移技术的选择n 靶细胞的选择靶细胞的选择 目目 录录目目 录录 目目 录录目目 录录160 。