基于耐盐性与矿质元素含量进行pho2突变体研究【研究意义】磷元素是植物生长发育所必须的矿质营养之一,由于磷矿是不可再生资源,在不久的将来面临磷矿资源的枯竭[1]然而在农业生产实践中,施用的磷肥仅有大约1/3的肥料被当季作物所利用,其余大量肥料被浪费,这样既不经济,也不环保,经常造成水体污染事件发生[2]培育磷养分高效作物,是可持续经济发展的重要途径之一,因此研究磷元素分子生理调控机制有重要的意义前人研究进展】在拟南芥和水稻中,对磷饥饿信号响应都有比较深入的研究[3,4]其中AtPHO2是一个重要磷信号调控基因,编码了泛素E2连接酶,通过泛素化作用降解AtPHO1蛋白,从而抑制了AtPHO1基因的功能,AtPHO1基因的主要功能是在木质部进行磷元素的转载和输出在水稻中鉴定出有3个AtPHO1的同源基因,分别是OsPHO1;1,OsPHO1;2和OsPHO1;3OsPHO1;2基因鉴定出来是在水稻中木质部进行磷元素装载和输出,从而将磷元素从根系转运到地上部分[5,6,7]OsPHO2还可以通过泛素化降解机制,调控PHT1蛋白在内膜上的含量,达到调控磷吸收转运的目的[8]另外OsPHO2转录本也会被miRNA399所降解,从而可以反馈抑制OsPHO2基因的表达[9]。
水稻中OsPHO2基因的突变,会造成突变体植株地上部磷元素超量累积,甚至高达数倍[10]本研究切入点】笔者对OsPHO2基因的印象一般是只与磷有关的,但是否可能参与了其他矿质营养的调控或是否对其他矿质元素的影响,尚不清楚拟解决的关键问题】本研究拟分析日本晴野生型和日本晴背景ospho2突变体,在正常种植的条件下,地上部分和种子中的矿质元素含量离子测试的结果表明Na离子的含量在水稻和高粱pho2中都有大量累积,而Na离子的含量是植物耐盐的重要指标之一[11,12]本文拟开展水稻和高粱pho2突变体萌芽期耐盐实验1、材料与方法1.1材料种植条件日本晴野生型WT和ospho2突变体(中科院遗传发育所储成才研究员提供的水稻ospho2突变体),发芽后进行营养液水培10d使用木村氏培养液,大量元素MgSO4·7H2O(0.5470mM);(NH4)2SO4(0.3650mM);KH2PO4(0.1820mM);KNO3(0.1830mM);Ca(NO3)2·4H2O(0.3660mM);微量元素MnCl2·4H2O(0.0005mM);H3BO3(0.0030mM);(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.0001mM);ZnSO4·7H2O(0.0004mM);CuSO4·5H2O(0.0002mM);NaFe-EDTA·3H2O(0.0400mM),调节pH值到5.5。
移栽于10kg土壤均一的塑料桶中,一桶挑选2株大小一致的苗,WT和突变体各种植3桶,共6桶在室外种植2个月左右,6-7月的沈阳,然后搬到温室中白天30℃/12h,晚上22℃/12h,光强约3万lx,湿度控制在70%左右,直至开花结实,成熟因水稻品种日本晴在沈阳夏季自然的室外条件下,沈阳日照时间较长,日本晴不易正常抽穗,所以进行这样种植方式1.2金属矿质元素含量的测定在日本晴和ospho2突变体成熟后,收取稻穗后,收获每个样品地上部分,先120℃杀青20min,然后80℃,烘干至恒重约2～3d时间测定时每个样品取2株长势一致的植株,地上混合在一起,然后用机器粉碎成粉末状日本晴和ospho2突变体每个品种2个生物学重复,每个生物学重复包含两株苗的均匀混合矿质元素测定时,采用ICP-OES(Optima8x00,PerkinElmer,USA)测定金属元素的含量样品称取0.1g左右,加浓硝酸5mL,0.5～1mLH2O2,然后采用微波消解仪MARS6.0(CEM,USA),按照标准程序进行微波消解,最终溶液呈无色透明状,然后通过约200℃高温加热,进行赶酸至约0.5mL,最后定容至50mL,其后按照仪器的操作规程进行金属元素含量的测定。
1.3总磷含量的测定样品的处理同上,称取样品0.1g左右,微波消解仪硝化完后,赶酸、定容至50mL,然后利用流动分析仪(San++System,SKALAR,Netherlands),采用钼酸铵显色法测定总磷的含量1.4水稻和高粱pho2突变体耐盐性比较高粱或是水稻干种子在10mL离心管中,首先用5%次氯酸钠溶液消毒5min,然后用灭菌水清洗洗3～4遍,然后在培养皿中铺上两层滤纸片,加上适量灭菌水或是1.2%的NaCl溶液,放入30℃恒温培养箱中培养,然后观察萌芽成苗状态植株的表型照片使用相机进行拍摄(EOS5D,Canon,Japan)1.5数据统计分析利用Excel2007进行数据的差异性显著性分析2、结果与分析2.1成熟期地上部日本晴野生型和ospho2突变体矿质元素含量分析在成熟期时,盆栽中的野生型日本晴和ospho2突变体,取样测定地上部分中的矿质元素含量,包括大量元素和微量元素结果表明在ospho2突变体中总磷的含量超量累积,总磷的含量几乎是野生型中的4倍(图1-A)不仅总磷的含量有所改变,其他元素含量也有改变其中钾(K)元素含量在突变体中增加了约16%,另外Mg元素的含量也增加了47%,Ca元素也有增加,但是统计上并不显著(图1-A)。
在微量元素的分析上,也有含量上有显著差异的元素Na,Zn,Cu总的含量较野生型没有显著性差异,但是Fe元素的含量较野生型是显著降低,而锰元素Mn的含量较野生型显著增加的,增加了将近84%的量(图1-B)图1成熟期野生型日本晴和突变体ospho2地上部离子含量图2野生型日本晴和突变体ospho2种子中离子含量2.2成熟期时日本晴野生型和ospho2突变体种子中矿质元素改变情况在盆栽条件下野生型和ospho2突变体成熟时期,我们对其种子进行矿质元素含量分析结果表明,在种子中,总磷的含量突变体较野生型是显著增加的,但是远远没有达到在地上部分积累的程度,相对野生型种子仅增加了30.27%;其中钾元素的含量也有所增加,在种子中较野生型增加了92.29%;Mg、Ca和Zn元素的含量也显示出了显著的增加;特别是Na元素在突变体中极显著的增加,其他元素如Mn、Fe、Cu的含量并没有统计上显著的差异变化(图2)研究表明在ospho2的突变体中有大量的非磷元素也有累积效应,特别是金属元素,不论是在种子中或是地上部分2.3稻和高粱pho2突变体萌发期耐盐性比较因在水稻ospho2突变体中,Na元素的含量显著累积(图2),同时在实验室构建的高粱EMS突变体库中[13]也筛选并克隆了高粱sbpho2突变体,在种子中Na元素的含量较野生型也是显著增加(未发表的数据)。
因Na离子含量是植株是否耐盐的重要指标之一,为了研究是否种子中过量累积的Na元素,会影响种子萌发期的耐盐特性,开展了盐胁迫实验通过以前的预实验,将NaCl的浓度定位1.2%高粱和水稻对盐胁迫处理的反应有不同在盐胁迫处理下,水稻中野生型的芽苗率逐步上升,最终达到平台期,而高粱中野生型芽苗率呈现从高峰逐渐下降的过程(图3-A和C)因为高粱中有些种子在盐胁迫下尽管开始时能够萌芽,但是随着盐处理天数增加会逐步死亡,而水稻的观察是只要种子萌芽了就会逐渐生长水稻和高粱pho2突变体在盐处理下较野生型芽苗率明显降低,相对芽苗率可以直观看到这一点,特别是在高粱中(图3-B和D)尽管在水稻中仅盐处理下第4天,突变体芽苗率较野生型在统计上有显著差异在高粱中突变体在所有的时间点,较野生型都是统计上的显著差异从15d盐胁迫表型照片,在对照条件下,高粱或是水稻pho2突变体较其野生地上部分生长状态差不多,而在盐胁迫条件下高粱或是水稻pho2突变体地上部分生长较野生型都有所抑制(图3-E到H)这些数据都表明高粱和水稻pho2降低了植株对盐胁迫的抗性图3水稻高粱pho2突变体耐盐性比较3、讨论首先简单总结一下磷饥饿信号的传导途径。
以水稻中的磷信号途径为例,以OsPHR2转录因子为核心在磷饥饿的条件下,OsPHR2激活下游各种PSI磷饥饿响应基因,如上调磷酸盐转运体基因,上调SQD或是PAP酸性磷酸酶,另外OsPHO2也会通过miRNA827或是miRNA399反馈抑制调控NLA(Nitrogenlimitationadaptation)或是OsPHO2的表达水平[14],而OsPHO2主要作用是抑制了OsPHO1(在木质部进行磷元素的装载和进行磷酸盐的输出efflux)以及通过泛素化降解,调整了PHT1家族磷酸转运体蛋白的含量,达到调控磷吸收的目的同时SPX蛋白可以通过与OsPHR2蛋白的互作,反馈抑制磷的激活信号而SPX蛋白基因可以通过结合OsPHR2对其产生抑制作用,从而抑制其对下游基因的激活作用[15]另外IPS1/2基因可以通过与miRNA399mimic作用,可以降解miRNA399而最终反馈调控它的表达,从而达到一个调控miRNA399的作用,这个基本上就是磷信号的调控途径OsPHO2基因编码的是一个泛素E2连接酶,在磷信号途径中主要起负调控作用在磷元素充足的条件下,OsPHO2通过泛素化降解了OsPHO1蛋白,而OsPHO1的功能是负责在磷元素从地下部分木质部转运磷元素到地上部分。
另外推测OsPHO2可能会对SPXgene或是其他磷饥饿响应基因(PSIgenes)有间接的抑制作用,但是缺乏直接的证据对OsPHO2的功能已经有很多的研究,突变后造成类似于激活了磷饥饿的信号,它在磷信号途径中的关键作用,也有一定的了解,但是对其他矿质元素的影响,基本没有太多的了解和报道先前的报道表明在水稻ospho2突变体中,地上部总的硝态氮含量较野生型是显著降低,可能是由于一个硝态氮转运体以及硝酸盐还原酶在根中的表达量降低,导致从根中向地上部分运输量的减少另外Fe的含量也在ospho2突变体显著根中增加,铁和磷的信号有一定的相互作用,在ospho2突变体中根部有显著的铁累积,地上部分Fe的积累并不显著很多Fe响应基因在突变体中表达上调了,如OsNAS1,OsNAS2,OsIRT1以及OsYSL15在突变体中的表达显著上调了,最终促进了植株Fe元素的吸收,造成在突变体根中累积了大量的Fe元素[10,16]初步的研究表明,OsPHO2基因的突变不仅仅是造成磷元素的超量积累,也造成了其他矿质元素含量的改变,大部分是增加通过对成熟期的WT日本晴和突变体ospho2,测定成熟期地上部分和种子的矿质元素的含量,研究表明在ospho2突变的情况下,在地上部分,除了磷元素大量的累积外,也发现了其他元素也累积了很多金属元素,诸如,钾、镁、铁和锰元素的含量在突变体的地上部分显著的累积,钾、镁、钙、钠以及锌等元素在突变体种子中,也有显著的增加。
在突变体的种子中或是地上部,矿质元素累积的趋势都是差不多不同的是在种子磷累积的量并没有如地上部分累积的那么多,仅仅较野生型有30%的增加,可能是因为磷元素从地上向种子中运输的时候,此时没有更多的磷相关的转运体并没有被OsPHO2调控的或是相关的PSI基因调控的程度并没有较地上部分那么高相比较而言,其他非磷元素的在突变体种子中的累积量较地上部分趋势是差不多,可能这些元素向籽粒中运输的相关的基因表达量较地上部分是差不多的所以这些元素的增加,可能是由于其相关的转运体的表达量被上调了,或是也有可能是鳌合的金属元素的释放增加了,造成这些元素的含量的增加另外的可能性可能是OsPHO2可能直接或是间接调控了这些基因的表达或是蛋白的含量,最后,这些基因可能是这些金属元素运输的重要的转运体另外现在的研究也表明有些钾高亲和转运体也可以进行一价或是二价离子的转运,如Na,K,Cu,Zn,Mg,Ca以及Fe等元素,也有可能是这些转运体将其他离子带入到植株体内[17],是。