黄酮提取工艺设计思路1、黄酮类化合物含量测定的原理 在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯合物，加入氢氧化钠溶液后 显红橙色黄酮类化合物能与金属离子络合产生有色反应，于波长 510nm 附近有吸收，可用分 光光度法进行测定实验采用在碱性条件下，亚硝酸盐存在时，硝酸铝与黄酮形成红色络合物， 在波长 510nm 附近有吸收可进行比色分析在中性或弱碱性及硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成鳌合物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，硝酸钠还原黄酮，加硝酸铝络合，加氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成2'-OH查耳酮 而显色利用黄酮类化合物中的3—羟基、4—羟基、5—羟基、4—羰基或邻二位酚羟基，与A13 +进行络 合反应，在碱性条件下生成红色络合物的原理测定其含量、测定波长的确定2取样品溶液和标准溶液2mL，加70 %的乙醇至5 mL,然后加入5 %的NaNO2 溶液 1 mL,室温放置6min,再加入10 %的A1(NO3)3 ImL,混匀，室温放置6 min,加入4%的NaOH 10mL,用水稀释至25 mL,混匀，放置15 min,在分光光度计上扫描波长从400 nm〜600 nm 之间的吸收度，结果在510nm波长处有最大吸收值。
配合物在 Kmax= 354nm 及 Kmax= 510nm 有两个吸收峰, 经实验后得出 Kmax= 112354nm 波长处 得到的工作曲线线性关系及精密度数据均不佳，故本实验选取Kmax= 510 2nm为测定波长3、标准溶液的配制精确称取105°C干燥恒重芦丁对照品50mg,加乙醇适量，使之充分溶解，用 乙醇定容到100mL,摇匀，制得芦丁溶液精确量取芦丁溶液20mL,置于50mL容量瓶中，用水 稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液每ImL溶液含芦丁对照品0.2mg或精密称取干燥至恒重 的芦丁标准品10mg,置50mL容量瓶中，加无水乙醇20mL,轻摇使充分溶解,定容，摇匀，得0. 2mg /mL 芦丁标准液精确称取芦丁标准品5mg，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容，即得每1mL溶液含芦丁 对照品0.1mg芦丁标准品溶液干燥器中冷却，精确称,C烘箱下烘干至恒重105芦丁标准品于称量瓶中置20mg称取约. 取 10 mg 芦丁标准品，用 70%乙醇定容至 100 ml 为标准液样品溶液的测定方法4 4.1、标准曲线的绘制精确量取对照品溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于25mL容量瓶中。
分别加水至6mL,加5%亚硝酸钠溶液1.0mL,混匀，放 置6mm;加10%硝酸铝溶液1.0mL,摇匀，放置6mm;加1%氢氧化钠溶液10.0mL,再加水至刻度，摇匀，放置15min用分光光度 法在510nm波长处分别测定其吸光度以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，用最小二乘法对直线 进行回归计算，令回归方程为：y=ax+b，绘制标准曲线，得回归线方程:Y = 11. 32143X + 0. 00343( r= 0.9998)，在8~40 ug/mL的范围内，浓度与吸收度有良好的线性关系 分别取0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 mL的0・ImgmL芦丁标准溶液于6支比色管中，分别 加入0. 3 mL 5%亚硝酸钠，放置6 min，加0. 3 mL 10%硝酸铝后放置6 min,，再加1. 0mol/L NaOH 4.0mL,加70%乙醇定容至10 mL,摇匀，放置12min得测定液以空白溶液作参比，在入 =510nm处测吸光度，计算标准液浓度(C)与吸光度(D)的回归方程D = bC + k精确吸取芦丁标准液0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0 ml分别置于6支具塞试管中，各补70%乙 醇至5. 0ml，加5%亚硝酸钠溶液0. 3 ml，，摇匀，放置6 mm后，加10%硝酸铝溶液0. 3ml，摇匀， 放置6 min后，再加4%氢氧化钠溶液4. 0ml，加水0. 4ml,摇匀，放置15 min后，在510 nm处测吸光度-浓度值，所得吸光度-浓度曲线见图，回归方程如下: A =12. 721 0C - 0.，相关系数 r = 0. 999802903。
样品处理4.2取采回的新鲜芦蒿叶，洗净，参考相关文献，在105°C烘至约八成干，剪成约1 cm 长度，用粉碎机粉碎，再在105C烘至恒重采用Soxhlet提取法，以无水乙醚为脱脂剂，于43C 水浴中脱脂至充分除去样品中脂类和脂溶性色素取出样品滤纸包，先置通风处晾干，再将滤 纸包置烘箱中130 C烘干，放入干燥器中冷却备用4・3、样品处理方法湿热法：将鲜叶置于高压反应釜加压蒸30min,另取鲜叶常压蒸30min将 阴干叶置于高压反应釜加压蒸15min，另取阴干叶常压蒸15min氧化法：（1） H2O2法：将鲜叶、阴干叶分别用用2倍量H2O2浸泡10mm （H2O2浓度C）、50、 2% （30min°C）、30、0.5% （30minC）、40、2% （10min°C）、50、温度 1%.60min （0.5%、40°C）、60min （1%、30°C）2） KMnO4 法：将鲜叶、阴干叶分别用用 2 倍量KMnO4 浸泡 10min（KMnO4 浓度 1%、温度 50C）、10min（2%、40C）、30min（0.5%、30C）、30min（2%、50C）、60min（0.5%、40C）、60min（1%、30C）。
4.3、样品溶液的测定4.3.1、分光光度法精确量取样品溶液5. 0 mL,置于25 mL容量瓶中，按照2.1中方法进行操作，在510nm波长处测定吸光度A1;再精确量取样品溶液5.0mL,置于25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，在 510nm波长处测定吸光度A2取2次吸光度的差值，由回归线方程计算样品中黄酮类化合物的 提取率HPLC法432、取上述样品总黄酮提取液浓缩物，用甲醇溶解，进样前用0.45 um滤膜过滤 高效液相色谱仪：LC- 9A（日本SHMADZU）；色谱柱：Dima Technologies（C18迪马公司），规 格：250 mm X4.6 mm；柱温为室温；流速1 mL/min；检测器：SPD-10A；检测波长254 nm；进 样量20 uL；流动相：80%甲醇在进柱之前，流动相要经过0.45 um的有机膜过滤，并超声 脱气 30 min溶剂选择5分别称取样品1g，以提取温度90C，提取时间2 h，分别利用甲醇、乙醇、丙酮、 乙酸乙酯、氯仿、石油醚为溶剂，料液比1:50（g/mL ）为提取条件进行常压回流提取，以此结果进 行比较6、线性范围、回归方程和检出限总黄酮的线性范围在1.0〜4 0ug/ml之间，所得回归方程为y=0.0033x—0.0109，相关系数为 0.9995，检出限为 1.0u g/ml。
显色剂稳定性实验7精确量取标准溶液和样品提取液1.0mL,同标准曲线和样品测定的操作， 分别于配制后每隔5min测定其吸光度考察反应体系的稳定性结果显示其RSD值为0. 5097% , 说明样品溶液在1h内稳定8、加标回收率实验取已测得黄酮类化合物提取率的样品溶液2.0mL,加入0.2mg/mL的芦丁对 照液 1. 0mL,该方法对，表明2. 135%值为99. 12%, RSD计算回收率加样回收率为，按实验方法测定 黄花菜中黄酮类化合物提取率测量的准确度较高回收率= （混合后测得的总黄酮含量-样品中总 黄酮含量）/芦丁标准品加入量X 100%分别取0.2g含总黄酮的样品于两支15ml具塞比色管中，各加入4ml乙醇，其中1管加入0.100mg 芦丁标准品作为加标测定管，另1 管作为本底管，再按最佳试验条件进行样品处理，用标准曲线 法进行计算，重复试验3次，计算回收率由表8可知，该方法的回收率为95%~104%，证明该 方法的准确度较好取5个10mL比色管，在已知黄酮含量的蓖麻叶和蓖麻花提取液中分别加入0.2mg/mL芦丁对照品溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL样液，分别测定黄酮含量，根据所得的总黄酮含量减去加入的标量，再除以样品所含的总黄酮量即可计算出回收率。
回收率％=样品加标准样测得总黄酮含量?样品中总黄酮含量/加入标准液总芦丁的含量X100%回收率 /%平均回收率/%样品测定值序号 加标量/mg加标后测定RSD/% 值) mg /ml(mg/ml0.2000 12 0.20003 0.20004 0.20000.200059、精密度实验取5份同一样品溶液各5.0mL,置于25mL容量瓶中，按实验方法测定，计算其平均含量和相对 标准偏差其RSD值平均为0.162%,测定结果的相对标准偏差很小，说明仪器的精密度较高，实 验数据可靠在正交试验得出的最佳条件下，样品用超声波提取后测定总黄酮提取量，重复试验 5次，计算保健食品总黄酮提取量为(5.370±0.092) mg, RSD为1.717%，证明该方法的精密度 较好按微波提取法同时制备5份试样液，按标准曲线方法对试样液中总黄酮含量进行平行测定 精密称取车前草供试品3份，每份测试3次,结果见表2，相对标准偏差为3. 20 %(m =3)精密移取芦丁标准液1mL,共5份，分别置于10mL试管中，按1.3.3.2节操作，计算吸光度的 相对标准偏差(RSD)10、重现性试验取同一批大白口蘑样品 6份，在最佳条件下进行萃取，分别测定各自的总黄 酮含量，结果表明，其相对标准偏差为1.24%。
在同一实验室、不同时间对样品叶中总黄酮含量进行5次重复测定11 、金属离子的干扰实验 银杏叶提取物作为生物活性物质, 许多金属离子对它的测定都有一定影响本实验选取常见的 Zn2+、Fe3+进行实验实验表明Zn2+对反应无影响，加入1 mL 100Lg?m L Fe3+ 溶液，扫描发现在波长510 nm无吸收峰，由此可知Fe3+对实验测定影响很大本实验选择 EDTA做掩蔽剂12、黄酮类化合物的定性检测 12.1、三氯化铝反应 取8支试管，分别加入少许经上述各提取方法所得的样品，用 95%乙醇完全溶解，每只试管中 再加1%三氯化铝乙醇溶液1〜2 mL,观察颜色变化情况在三氯化铝反应中，原来的黄色加深， 并有黄色或黄绿色荧光，原因是与铝离子产生了螯合物而呈现出鲜黄色滤纸上无明显颜色变化， 紫外灯下显鲜黄色荧光，可能不含 4'-羟基黄酮醇和 7，4'-二羟基黄酮醇等黄酮类化合物 黄色 或黄绿色：有黄酮类化合物盐酸-镁粉还原反应 12.2将经上述各提取方法所得的样品分别溶于盛有 95%乙醇的试管中， 待完全溶解后加少许镁粉，再加数滴浓盐酸,观察颜色变化情况在盐酸- 镁粉还原反应中,溶液 呈现出橙黄色或紫红色,这是由于黄酮类化合物被还原生成花色苷元及其二聚物。
试液呈现红色， 可能含黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等黄酮类化合物取样品液5mL,加入少许镁粉振摇，滴加数滴浓盐酸，微热2min并作空白对照实验(在样品 液中仅加入浓盐酸进行观察)可观察到在用粗提取液进行预试时，加入浓盐酸后升起的泡沫颜 色呈紫红色，溶液显橙红色，表明样品液中有黄酮类物质存在 橙红色：黄酮类化合物取自制的黄酮样品少许置于试管中，加5%vol的乙醇2mL,在水浴中加热溶解，滴加2,即产生 剧烈的反应反应过程中溶液颜色逐渐由黄色变为橙50mg，再加镁粉约HC1滴浓. 红色此现象表明被测物为黄酮类物质四氢硼钠反应 1 2.3取8支试管，分别加入少许经上述各种方法提取所得到的样品，用 95% 乙醇完全溶解后加数滴四氢硼钠，观察颜色变化。