复旦大学 硕士学位论文 单核细胞趋化蛋白-1对子宫内膜间质细胞分泌血管内皮生长因 子的影响 姓名：顾彧 申请学位级别：硕士 专业：妇产科学 指导教师：林金芳 20040430 复旦大学硕士学位论文 中文摘要 单核细胞趋化蛋白．1 对子宫内膜间质细胞 分泌血管内皮生长因子的影响 中文摘要 目的： 研究已提示细胞因子血管内皮生长因子( V E G F ) 在子宫内膜异位症的发生 和发展中可能起重要作用本研究通过离体实验观察体外培养的子宫内膜间质细 胞分泌V E G F 的功能，并了解趋化因子单核细胞趋化蛋白一I ( M C P ．1 对子宫 内膜间质细胞分泌V E G F 的影响，以探讨子宫内膜间质细胞分泌的V E G F 在子 宫内膜异位症早期发生中的重要性，以及趋化因子M C P 一1 的参与作用 材料与方法： l 、标本收集 ( 1 ) 病例选择：选择l O 例因单纯子宫肌瘤作全子宫切除者作对照组( 非E M 组) 和1 0 例因子宫内膜异位症作根治术者作实验组( E M 组) ，切除子宫 后自宫底部刮取其子宫内膜：对照组和实验组均为处于卵泡期患者，子宫 内膜经病理诊断为增生晚期子宫内膜。
( 2 ) 标本处理：在无菌操作下将子宫内膜送实验室作子宫内膜间质细胞分离、 贴壁后收集，并作纯度鉴定和细胞悬液制备 2 、细胞培养：按细胞数2 ×1 0 5 ／孔接种2 4 孔板，在两组细胞培养液中分别加入 不同培养介质：1 7 一B 雌二醇( E 2 、浓度为1 0 一m o l ／L ) 、M C P 一1 ( 浓度为5 0 1 a g ／L ) 或[ E 2 0 0 罐m o l ／L ) + M C P ．1 ( 5 0 r t g ／L ) ] ，并设仅有培养液的空白对照组，在 同等条件下共培养4 8 小时，每2 4 小时更换培养液，分别收取前2 4 小时和 后2 4 小时各组细胞的培养上清液 3 、细胞因子测定：采用酶链免疫吸附试验( E L I S A ) 法测定各组培养液中V E G F 的浓度 4 、统计学分析：非E M 组和E M 组组间V E G F 浓度的差别采用方差分析，各组 内差别采用D u r m e t tC 法进行统计学检验，均使用S P S S l l ．0 统计软件 ——一一 墨里查堂璧主兰堡堡壅 ! 壅塑墨 结果： l 、非E M 组：体外培养2 4 小时，仅有培养液的空白对照组的V E G F 浓度为 5 4 6 ．0 0 + 1 0 ．3 9 p g ／L ；在培养液中分别加入E 2 、M C P 。
l 或( E 2 + M C P ．1 ) 后的 各组V E G F 浓度分别为9 1 3 ．5 0 ±1 1 ．2 4 蜡，L 、9 9 2 ．2 5 ±5 3 ．6 1 a g ／L 和1 2 4 8 ．0 0 ±2 7 ．9 8 r t g ／L ，与仅有培养液的空白组相比，V E G F 浓度增加，差异均具显著 性，P O ．0 5 ． C o n c l u s i o n s ： I ．E S C so fc o n t r o la n de n d o m e t r i o s i sg r o u ps e c r e tV E G Fw h e nc u l t u r e di nv i t r o ， w h i c hs u g g e s t e dt h a tV E G Fs e c r e t e db yE S C sm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n a n g i o g e n e s i so f t h ee c t o p i cl e s i o n a te a r l ys t a g eo f e n d o m e t r i o s i s ． 2 ．E s t r a d i o lC a ns t i m u l a t eV E G Fs e c r e t i o no fE S C s ，i n d i c a t i n gt h a tE S C sm a y b e o n e o f t h ek e ys i t eo f e s t r a d i o lt os t i m u l a t et h ea n g i o g e n e s i so f e n d o m e t f i o s i s ． 3 ．C h e m o k i n eM C P ．1C a l ls t i m u l a t et h eE S C s t os e c r e tV E G F , w h i c hi si n d e p e n d e n t o ft h ee s l x a d i 0 1 ．F u r t h e r m o r e ．m e r ei Sa na d d i t i o n a lo rs y n e r g e t i ce f f e c tb e t w e e n t h ee s t r a d i o la n dM C P ．1 ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tM C P - 1i sap r o m o t i v ef a c t o ro f E S C si nV E G Fs e c r e t i o n ． 4 ．T h er e s p o n s i v e n e s so fE S C sf r o me n d o m e t r i o s i sg r o u pt oE 2a n dM C P 一1w a s h i g h e r t h a nt h a to fE S C sf r o mc o n t r o lg r o u p ，w h i c hs u g g e s t e d t h a tt h e s u s c e p t i b i l i t i e so f h e r e d i t ye x i s t e di ne n d o m e t r i o s i sp a t i e n t s ． K e y w o r d s ： e n d o m e t r i o s i s e n d o m e t r i a ls t r o m a lc e l li n d u c e s t r o m a 0 e s t r a d i o l M o n o c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n - 1 ( N ；I C P 一1 ) V a s c u l a re p i t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( V E G F ) 6 复旦大学硕士学位论文 前言 —1 上▲—j ‘ 日U舌 子宫内膜异位症( e n d o m e t r i o s i s ，E M ) 是一种以进行性发展为特点的妇产 科常见病，可引起痛经、性交痛及不孕，严重危害妇女健康。
发病率呈逐年上升 趋势，但病因尚未完全阐明传统的子宫内膜异位症发生学学说有①经血倒流子 宫内膜种植学说②体腔上皮化生学说和③淋巴转移学说等近年提出E M 发生的 诱导学说，该学说认为由子宫内膜碎片释放的某种未知物质诱导了未分化的间充 质形成子宫内膜异位组织或促进异位子宫内膜在盆腹膜的种植⋯诱导学说成为 众多学者关注的焦点现已发现的可能诱导子宫内膜异位症发生的因素有①甾体 激素、②细胞因子、③趋化因子、④黏附分子、⑤化学物质以及⑥炎症等许多 研究证明遗传学因素决定了子宫内膜异位症发病的易感性，而诱导因素则作为外 部促进发病的因素；这些特定的诱导因子成为当前研究热点 具有功能活性的子宫内膜组织异位生长于子宫腔外形成子宫内膜异位病灶， 血管的生成对异位子宫内膜组织的生长具有重要作用1 2 “，盆腹膜上异位子宫内 膜病灶的周边存在丰富的新生血管是新兴起和活跃的子宫内膜异位病灶的一个 显著的特点【2 卅越来越多的证据表明血管生成参与了子宫内膜异位症的发生和 发展【引，而血管的生成又受到多种因子的调节这些因子包括酸性及碱性成纤维 生长因子和血管内皮生长因子( v a s c u l a r e n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ，V E G F ) 。
V E G F 与它的两个受体f m s 样酪氨酸激酶( f m s - l i k et y r o s i n ck i n a s e ，F i t ) 和激酶类受体 ( k i n a s ed o m a i nr e c e p t o r ，K D R ) 之一结合后1 7 J ，发挥其促进内皮细胞的增殖作用 和血管生成过程中一些蛋白激酶的表达，并提高血管通透性俐 研究发现子宫内膜异位症妇女腹腔液中的V E G F 浓度高于正常妇女，并与内 膜异位症的严重程度有关[ 2 ，⋯腹腔液中的V E G F 主要来源于巨噬细胞[ 2 1 ，且子 宫内膜异位症患者腹腔液中巨噬细胞较正常者多，但是内异症患者腹腔液中臣噬 细胞增多及活性的增强是子宫内膜异位病灶种植后继发的一种免疫反应的结果 【lo 】；关于在子宫内膜异位病灶形成早期阶段，V E G F 的来源及其作用方式尚不清 楚有研究表明在位及异位的子宫内膜间质细胞均能分泌V E G F l l “，并可能对子 宫内膜异位病灶周围的血管生成起重要作用，从而促进子宫内膜异位病灶的发生 发展；S h i f r e n 等【J 2 】也发现人子宫内膜细胞能表达V E G F m R N A ，并比较了月经 周期各期中人子宫内膜表达V E G F m R N A 及其蛋白的不同，发现子宫内膜表达 复旦大学硕士学位论文 前言 V E G F m R N A 水平从增殖早期开始增加，至分泌期最高；D a n n e zJ 等【1 3 】则发现子 宫内膜异位症患者分泌晚期子宫内膜腺上皮表达V E G F m R N A 水平较同期正常 子宫内膜显著增高，因而认为子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜可能较正常子 宫内膜更容易种植而发病。
由于大部分的免疫组织化学研究表明，V E G Fm R N A 的表达高峰出现在月经 周期的分泌期，且主要局限于子宫内膜腺上皮细胞，而问质细胞中很少出现且较 分散⋯_ ‘2 】，因而子宫内膜间质细胞分泌V E G F 在子宫内膜异位症发生发展中的作 用未受到学术界的重视但体腔上皮化生学说指出，子宫内膜问质细胞的出现早 于腺体的出现f J o ／，而病理组织学研究也发现某些子宫内膜异位种植病灶的腺体崩 解，只有间质细胞存在，且伴有高度血管化1 1o J 近年来N i s o l l e M 等1 1 4 j 的子宫内 膜异位种植研究发现，将人子宫内膜种植于小鼠腹腔，免疫组化证据表明在子宫 内膜异位病灶形成之前，子宫内膜间质细胞已有V E G F m R N A 的表达，这说明了 子宫内膜间质细胞分泌的V E G F 可能在子宫内膜异位症发生的早期阶段起重要 作用，但尚无直接证据证实 近年来随着对本病的深入研究，有报道认为炎症与子宫内膜异位症发生密切 相关‘1 5 翻，但两者的因果关系目前尚不清楚Y i hS 等发现炎症过程中产生的炎 症趋化因子单核细胞趋化蛋白一1 ( m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n tp r o t e i n 一1 ，M C P 一1 ) 在子宫内膜异位症患者的腹腔液或周围血中的浓度均较正常者高，提示M C P - 1 可能与子宫内膜异位症的发生有关【1 6 】。
本研究采用离体培养的子宫内膜间质细 胞，研究子宫内膜间质细胞分泌的V E G F 的功能及雌激素的调节作用，。