分子标记技术及其在真菌中的应用摘要 对RFLP、AFLP、SSR、SNP这些常用的DNA分子标记技术的原理、 特点以及其在真菌中的应用进行了综述关键词 分子标记；RFLP； AFLP； SSR； SNP；真菌遗传标记(Genetic marker)是研究生物遗传变异规律及其物质 基础的重要手段它具有2个基本特征,即可遗传性和可识别性因此, 生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记随着遗传学 的不断发展,遗传标记的种类和数量也不断增加目前,应用较为广泛 的遗传标记有形态标记(Morphologi2cal maker)、细胞标记(Cytological maker)、生化标记(Biochemical maker) 和分子标记 (Molecular maker) [1] 形态标记指植物的外部形态特征(矮秆、紫鞘、卷叶等) ；细胞标记 主要是染色体的核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等) 和带型(C带、N带、G带等)；生化标记主要包括同工酶和等位酶标 记这3 种标记都是基因表达的结果,是对基因的间接反映,标记数目 有限，多态性较差，易受环境条件的影响而分子标记是直接在DNA分 子上检测生物间的差异是在DNA水平上遗传变异的直接反映。
1 分子标记及其特点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较 为理想的遗传标记形式， 它以蛋白质、核酸分子的突变为基础， 检测生 物遗传结构与其变异分子标记技术从本质上讲， 都是以检测生物个 体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异分子 标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类第一类是以分 子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism,简称RFLP标记）、DNAf旨 纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（in situ hybridization）等； 第二类是以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction简称PCR反 应）为核心的分子标记技术,包括随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA,简称RAPD标记）、扩展片段长度多 态性标记（Amplified fragment length polymorphism,简称 AFLP 标记）、 简单序列重复标记（Simple sequence repeat,简称SSR标记）、序标位（Sequence tagged sites,简称STS标记）、序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region,简称SCAR标记）等； 第三类 是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism,简称SNP标记）、表达序列标签（Expressed sequences tags,简称EST标记）等。
每一种分子标记都有其自身的特点和特定的 应用范围,但就一般意义而言,DNA分子标记与形态标记和生化标记 等相比，具有许多独特的优点：①不受组织类别、发育阶段等影响 ②不受环境影响因为环境只影响基因表达（转录与翻译），而不改变 基因结构即DNA的核苷酸序列③标记数量多遍及整个基因组④ 多态性高，自然存在许多等位变异⑤有许多标记表现为共显性能够 鉴别纯合基因型和杂合基因型 提供完整的遗传信息⑥DNA分子标 记技术简单、快速、易于自动化⑦提取的）NA样品,在适宜条件下 可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利2因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的 许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景1.1 第一代分子标记1. 1. 1 RFLP标记技术980年Botesin提出的限制性片段长度多 态性(Res trie tion fragme nt leng th polymorphisms ,RFLP开创了 直接应用DNA多态性的新阶段是最早应用的分子标记技术3］RFLP指限制性内切酶酶解不同个体基因组后，含有同源序列的 酶切片段长度的差异限制性内切酶能识别序列上有特定碱基组成的 识别位点，并在识别位点切开，使很长的分子降解成长短不一的片段， 片段的数目和长度反映了限制性内切酶切点的分布，对于特定的NA 限制性内切酶组合，所降解的片段的数目和长度是特异的，因此可以 作为某一基因组的特有“指纹” (fingerprinting)。
这种特异的指纹 图谱具有高度的特异性 碱基序列不同或发生插入、缺失、易位、 碱基替换、基因重叠、碱基修饰等变异都能引起指纹图谱的变化，因 此指纹图谱可用于个体遗传变异的鉴定RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点, 结果稳定可靠, 重复 性好,特别适应于构建遗传连锁图但是，在进行RFLP分析时，需要该 位点的DNA片段做探针，用放射性同位素及核酸杂交技术既不安全又 不易自动化另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高RFLP连锁 图上还有很多大的空间区［4］1.1.2 RFLP在真菌中的应用RFLP因其能展示大量的遗传标记，最初用于人类遗传病的诊断，近年来在真菌分类鉴定和系统分析中也已广泛应用Forster〔5］等利用RFLP技术对疫霉属(Phy to ph thora)真菌的6个种的线粒体DNA进行 了多态性分析，发现这项技术不仅可以区别种，甚至可以区别来自不 同地理环境和寄主的种以下的分类单元亚群通过对线粒体DNA限制 性片段多态性分析，Croft［6］等人对曲霉属(Aspergillus)的两个种 A. iaponicus与A. aculeatus的分子特征与表型特片之间的关系作了 分析，经过研究，他们将A. japonicus与A. aculeatus的菌株分成7 个不同的线粒体DNA的酶切片段群，并由此证明线粒体DNA的RFLP的分 析在对黑曲霉的野生型分离株的特征界定上是一个非常有用的分析 工具。
Fliegerova〔7］等应用RFLP技术，成功的区分开厌氧真菌 Anaeromyces属中的不同菌株，因所用菌株数量偏少，作者在讨论中 指出，尚需要更多不同来源、不同地域的菌株方能证实该结论1.2 第二代分子标记1. 2 .1 AFLP标记技术扩增片段长度多态技术(AFLP),又名限 制片段选择扩增技术(Selec tive res trie tion fragment amplification,SRFA),于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和 Vos 等发明［8］ AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术, 它 将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与 酶切位点互补)连接起来,并通过5’端与接头互补的半特异性引物 扩增得到大量DNA片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术OAFLP指 纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传它兼真APD与RFLP的优点，有 较高的稳定性, 用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点, 并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染 色体上，各染色体上AFLP标记的数目与染色体长度呈正相关(r二0. 501) , 而一对引物获得的标记涉及的染色体数与标记数呈正相关( r = 0. 826) 。
因此， 通过少量效率高的引物组合， 可获得覆盖整个基因 组的AFLP标记⑼1. 2 .2 AFLP在真菌中的应用目前,AFLP作为一种高效的指纹技术已在遗传育种研究中发挥它的 优势 Azuml ［io］等使用9对引物，对Saccharomyces sensu stricto的 工业、实验室及典型菌株进行AFLP定性分析得到了此酵母的表型图 谱，并将S. cerevisiae群簇分为三个亚群1998年Pateharag等用 这种方法分析黑胫茎点霉(Lep to phaerla rnaculara)，获得了基因 对基因假说的进一步证据Miguel ［12］等报道了AFLP用于酵母菌遗传 多样性的分析Terashima ［⑶等应用AFLP技术对日本的Lentlanula edobes(香菇)的培养菌株进行了遗传多样性和菌株分型研究评估了 日本L. edobes主要培养菌株之间的AFLP变化范围，评价了AFLP作为 遗传标记在菌株分型上的实用性，并揭示了它们之间的遗传相关性1.2 .3 SSR 标记技术在真核生物基因组中存在许多非编码的重 复序列，如重复单位长度在15〜65个核苷酸的小卫星DNA(Minisatellite DNA)，重复单位长度在2〜6个核苷酸的微卫星 DNA(Microsatellite DNA)［⑷。
小卫星和微卫星DNA分布于整个基 因组的不同位点由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同， 从而构成丰富的长度多态性Moore等于1991年结合PCR技术创立了SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)标记技术SSR也称微卫星DNA , 是一类由几个(多为1〜5个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列，其中最常见的是双核苷酸重复即(CA) n和(TG) n,每个微卫星 DNA 的核心序列结构相同, 重复单位数目10〜60 个, 其高度多态性主 要来源于串联数目的不同不同遗传材料重复次数不同导致了 SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR标记产生的基础SSR标记 的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物, 通过 PCR 反应扩增微卫星片段由于核心序列重复数目不同, 因而扩增出 不同长度的PCR产物,这是检测DNA多态性的一种有效方法微卫星 序列在群体中通常具有很高的多态性, 而且一般为共显性, 因此是一 类很好的分子标记1. 2 .3 SSR在真菌中的应用Lieckfeldt［15］等于1993年第一次报道了用SSR作为单引物对酵母基 因组的扩增。
目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、 小麦、玉米等物种的染色体遗传图谱这些微卫星标记已被广泛应用 于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种 进化研究等领域［16］此外,SSR标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体 而且结果更加可靠, 方法简单, 省时省力1.3 第三代分子标记1. 3. 1 SNP标记技术单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP)被称为第三代DNA分子标记，是指同一位点的 不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失 或插入[17],更常见的是单个核苷酸的替换且常发生在嘌吟碱基（A 与G）和嘧啶碱基（C与T）之间SNP标记可帮助区分两个个体遗传 物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记1. 3. 2 SNP在真菌中的应用目前, 已有236多个标记定位于真菌, 在人类染色体上也已发展出2 000个SNP标记在这些SNP标记中大约有30 %包含限制性位点 的多态性检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，最新报道的微芯片 电泳（Microchip elec trophoresis），可以高速度地检测临床样品的 SNP ， 它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10 和50倍 。
SNP 与第1代的RFLP及第2代的SSR标记的不同有两个方面:其一,SNP 不再以DNA片段的长度变化作为检测手段而直接以序列变异作为标 记;其二， SNP 标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳， 代之以最新的 DNA 芯片技术2 结语DNA分子标记技术在植物病原真菌鉴定上的应用给植物病原鉴定带来 了一次革命，它突破了形态学或同工酶等作为分类依据的传统观念 这一技术。