G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O 1 5 7: H 7 /NM检验 1 范围 本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM(E s c h e r i c h i ac o l iO 1 5 7:H 7/NM) 的检验方法 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM的检验 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下: 2.1 恒温培养箱:3 61 2.2 冰箱:25 2.3 恒温水浴箱:4 61 2.4 天平: 感量0.1g、0.0 1g 2.5 均质器 2.6 显微镜:1 0倍1 0 0倍 2.7 无菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或移液器及吸头 2.8 无菌均质杯或无菌均质袋: 容量5 0 0m L 2.9 无菌培养皿: 直径9 0mm 2.1 0 p H计或精密 p H试纸 2.1 1 长波紫外光灯:3 6 5n m, 功率6W 2.1 2 微量离心管:1.5m L或2.0m L 2.1 3 磁板、 磁板架、 样品混合器。
2.1 4 微生物鉴定系统 3 培养基和试剂 3.1 改良E C肉汤(m E C+n) : 见A.1 3.2 改良山梨醇麦康凯琼脂(C T - S MA C) : 见A.2 3.3 三糖铁琼脂(T S I) : 见A.3 3.4 营养琼脂: 见A.4 3.5 半固体琼脂: 见A.5 3.6 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤- MUG(MUG - L S T) : 见A.6 3.7 氧化酶试剂: 见A.7 3.8 革兰氏染色液: 见A.8 3.9 P B S - T w e e n2 0洗液: 见A.9 3.1 0 亚碲酸钾(A R级) G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 2 3.1 1 头孢克肟(C e f i x i m e) 3.1 2 大肠埃希氏菌O 1 5 7显色培养基 3.1 3 大肠埃希氏菌O 1 5 7和H 7诊断血清或O 1 5 7乳胶凝集试剂 3.1 4 鉴定试剂盒 3.1 5 抗-E.c o l iO 1 5 7免疫磁珠 第一法 常规培养法 4 检验程序 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM常规培养法检验程序见图1 图1 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM常规培养法检验程序 5 操作步骤 5.1 增菌 以无菌操作取检样2 5g( 或2 5m L) 加入到含有2 2 5m Lm E C+n肉汤的均质袋中, 在拍击式均质 器上连续 均 质1 m i n2 m i n; 或 放 入 盛 有2 2 5 m L m E C+n肉 汤 的 均 质 杯 中,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n 2m i n。
3 61培养1 8h2 4h G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 3 5.2 分离 取增菌后的m E C+n肉汤, 划线接种于C T - S MA C平板和大肠埃希氏菌O 1 5 7显色琼脂平板上, 3 61培养1 8h2 4h, 观察菌落形态在C T - S MA C平板上, 典型菌落为圆形、 光滑、 较小的无色 菌落, 中心呈现较暗的灰褐色; 在大肠埃希氏菌O 1 5 7显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行 判定 5.3 初步生化试验 在C T - S MA C和大肠埃希氏菌O 1 5 7显色琼脂平板上分别挑取5个1 0个可疑菌落, 分别接种 T S I琼脂, 同时接种MUG - L S T肉汤, 并用大肠埃希氏菌株(AT C C 2 5 9 2 2或等效标准菌株) 做阳性对照 和大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7(N C T C 1 2 9 0 0或等效标准菌株) 做阴性对照, 于3 6 1 培养1 8h 2 4h 必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色在T S I琼脂中, 典型菌株为斜面与底层均呈黄色, 产气或 不产气, 不产生硫化氢(H2S) 置MUG - L S T肉汤管于长波紫外灯下观察, MUG阳性的大肠埃希氏菌 株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生, 大肠埃希氏菌O 1 5 7: H 7/NM为MUG试验阴性, 无荧 光。
挑取可疑菌落, 在营养琼脂平板上分纯, 于3 61培养1 8h2 4h, 并进行下列鉴定 5.4 鉴定 5.4.1 血清学试验 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落, 用O 1 5 7和H 7诊断血清或O 1 5 7乳胶凝集试剂作玻片凝集试 验对于H 7因子血清不凝集者, 应穿刺接种半固体琼脂, 检查动力, 经连续传代3次, 动力试验均阴 性, 确定为无动力株如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂, 应按照产品说明书进行 5.4.2 生化试验 5.4.2.1 自营养琼脂平板上挑取菌落, 进行生化试验大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM生化反应特征见 表1 表1 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM生化反应特征 生化试验特征反应 三糖铁琼脂底层及斜面呈黄色,H2S阴性 山梨醇阴性或迟缓发酵 靛基质阳性 甲基红-伏普试验(MR - V P) MR阳性,V P阴性 氧化酶阴性 西蒙氏柠檬酸盐阴性 赖氨酸脱羧酶阳性( 紫色) 鸟氨酸脱羧酶阳性( 紫色) 纤维二糖发酵阴性 棉子糖发酵阳性 MUG试验 阴性( 无荧光) 动力试验有动力或无动力 G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 4 5.4.2.2 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统, 应从营养琼脂平板上挑取菌落, 用稀释液制备成浊 度适当的菌悬液, 使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
5.4.3 毒力基因测定( 可选项目) 样品中检出大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7或O 1 5 7:NM时, 如需要进一步检测V e r o细胞毒素基因的存 在, 可通过接种V e r o细胞或H e L a细胞, 观察细胞病变进行判定; 也可使用基因探针检测或聚合酶链反 应( P C R) 方法进行志贺毒素基因(s t x1、s t x2) 、e a e、 h l y 等基因的检测如使用试剂盒检测上述基因, 应 按照产品的说明书进行 6 结果报告 综合生化和血清学试验结果, 报告2 5g( 或2 5m L) 样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7 或大肠埃希氏菌O 1 5 7:NM 第二法 免疫磁珠捕获法 7 检验程序 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2 图2 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM免疫磁珠捕获法检验程序 G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 5 8 操作步骤 8.1 增菌 同5. 1 8.2 免疫磁珠捕获与分离 8.2.1 应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离当生产商的使用说明与下面的描述 可能有偏差时, 按生产商提供的使用说明进行。
8.2.2 将微量离心管按样品和质控菌株进行编号, 每个样品使用1只微量离心管, 然后插入到磁板架 上在漩涡混合器上轻轻振荡E. c o l iO 1 5 7免疫磁珠混悬液后, 用开盖器打开每个微量离心管的盖子, 每管加入2 0LE.c o l iO 1 5 7免疫磁珠悬液 8.2.3 取m E C+n肉汤增菌培养物1m L, 加入到微量离心管中, 盖上盖子, 然后轻微振荡1 0s每个 样品更换1只加样吸头, 质控菌株必须与样品分开进行, 避免交叉污染 8.2.4 结合: 在1 83 0环境中, 将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微 转动1 0m i n, 使E.c o l iO 1 5 7与免疫磁珠充分接触 8.2.5 捕获: 将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠在3m i n内不断地倾斜磁板架, 确保悬液中与盖子上的 免疫磁珠全部被收集起来此时, 在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物 8.2.6 吸取上清液: 取1支无菌加长吸管, 从免疫磁珠聚集物对侧深入液面, 轻轻吸走上清液当吸到 液面通过免疫磁珠聚集物时, 应放慢速度, 以确保免疫磁珠不被吸走如吸取的上清液内含有磁珠, 则 应将其放回到微量离心管中, 并重复8. 2.5步骤。
每个样品换用1支无菌加长吸管 免疫磁珠的滑落: 某些样品特别是那些富含脂肪的样品, 其磁珠聚集物易于滑落到管底在吸取上 清液时, 很难做到不丢失磁珠, 在这种情况下, 可保留5 0L1 0 0L上清液于微量离心管中如果在 后续的洗涤过程中也这样做的话, 脂肪的影响将减小, 也可达到充分捕获的目的 8.2.7 洗涤: 从磁板架上移走磁板, 在每个微量离心管中加入1m LP B S - T w e e n 2 0洗液, 放在样品混合 器上转动或用手轻微转动3m i n, 洗涤免疫磁珠混合物重复上述步骤8. 2.58.2.7 8.2.8 重复上述步骤8.2.58.2.6 8.2.9 免疫磁珠悬浮: 移走磁板, 将免疫磁珠重新悬浮在1 0 0LP B S - T w e e n 2 0洗液中 8.2.1 0 涂布平板: 将免疫磁珠混匀, 各取5 0L免疫磁珠悬液分别转移至C T - S MA C平板和大肠埃希 氏菌O 1 5 7显色琼脂平板一侧, 然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半, 再用接种环划线接种平 板的另一半待琼脂表面水分完全吸收后, 翻转平板, 于3 61培养1 8h2 4h 注:若C T - S MA C平板和大肠埃希氏菌O 1 5 7显色琼脂平板表面水分过多时,应在3 6 1 下干燥1 0m i n 2 0m i n, 涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。
8.3 菌落识别 大肠埃希氏菌O 1 5 7:H 7/NM在C T - S MA C平板和大肠埃希氏菌O 1 5 7显色琼脂平板上的菌落特 征同5. 2 8.4 初步生化试验 同5. 3 8.5 鉴定 同5. 4 G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 6 9 结果报告 同第6章 G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 7 附 录 A 培养基和试剂 A.1 改良E C肉汤(m E C+n) A.1.1 成分 胰蛋白胨 2 0.0g 3号胆盐1.1 2g 乳糖 5.0g K2H P O47 H2O4.0g KH2P O41.5g N a C l5.0g 新生霉素钠盐溶液( 2 0m g /m L) 1.0m L 蒸馏水 10 0 0m L A.1.2 制法 除新生霉素外, 所有成分溶解在水中, 加热煮沸, 在2 02 5下校正 p H 至6. 90.1, 分装于 1 2 1高压灭菌1 5m i n, 备用制备浓度为2 0m g/m L的新生霉素储备溶液, 过滤法除菌待培养基温 度冷至5 0以下时, 按10 0 0m L培养基内加1m L新生霉素储备液, 使最终浓度为2 0m g/L。
A.2 改良山梨醇麦康凯(C T - S MA C) 琼脂 A.2.1 山梨醇麦康凯(S MA C) 琼脂 A.2.1.1 成分 蛋白胨 2 0.0g 山梨醇 1 0.0g 3号胆盐1.5g 氯化钠 5.0g 中性红 0.0 3g 结晶紫 0.0 0 1g 琼脂 1 5.0g 蒸馏水 10 0 0m L A.2.1.2 制法 除琼脂、 结晶紫和中性红外, 所有成分溶解在蒸馏水中, 加热煮沸, 在2 0 2 5 下校正 p H 至 7.20.2, 加入琼脂、 结晶紫和中性红, 煮沸溶解, 分装于1 2 1高压灭菌1 5m i n A.2.2 亚碲酸钾溶液 A.2.2.1 成分 亚碲酸钾 0.5g G B4 7 8 9.3 62 0 1 6 8 蒸馏水 2 0 0m L A.2.2.2 制法 将亚碲酸钾溶于水, 过滤法除菌 A.2.3 头孢克肟(C e f i x i m e) 。